Cinwaanka hadda jira: OX11 0DE, UK, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, UK, Diamond Light Source Co., Ltd., Xarunta Sawirka Bayoolojiga Elektarooniga ah.
Isku-dhafka iftiinka-goosashada ee xarunta falcelinta 1 (RC-LH1) waa qaybta ugu muhiimsan ee sawir-sameynta bakteeriyada sawir-qaadista guduudan. Waxaan soo bandhignay laba qaab-dhismeed oo cryo-electron ah oo isku-dhafka RC-LH1 ah oo ka yimid Rhodopseudomonas palustris. Qaab-dhismeedka xallinta 2.65-Å ee isku-dhafka RC-LH114-W wuxuu ka kooban yahay 14 wareeg oo LH1 ah oo ku wareegsan RC, kaas oo ay kala goyso borotiinka W, halka isku-dhafka aan lahayn borotiinka-W uu gebi ahaanba ka kooban yahay isku-dhafka RC oo ay ku hareeraysan yihiin RC. 16 wareeg oo LH1 ah oo xiran. Isbarbardhigga qaab-dhismeedkan wuxuu bixiyaa aragtiyo ku saabsan dhaqdhaqaaqa quinone ee isku-dhafka RC-LH1, oo ay ku jiraan isbeddellada qaab-dhismeedka ee aan hore loo go'aamin marka lagu xidho quinone goobta RC QB, iyo sidoo kale goobta goobaha isku-xidhka quinone ee caawiya, kuwaas oo ka caawiya inay u gudbaan RC. Qaab-dhismeedka gaarka ah ee borotiinka W wuxuu ka hortagayaa xidhitaanka wareegga LH1, taasoo abuuraysa kanaal lagu dedejiyo is-weydaarsiga quinone/quinolone.
Tamarta ay bixiso sawir-qaadistu waxay sii wadi kartaa ku dhawaad ​​​​dhammaan nolosha dhulka, waxayna leedahay awood weyn oo loogu talagalay bayotechnoolajiyadda qorraxda. Iyadoo kor u qaadaysa sawir-qaadis caalami ah, bakteeriyada sawir-qaadis guduudan ayaa sidoo kale muujisa qaabab tamar oo kala duwan iyo awoodaha dheef-shiid kiimikaadka. Waxay ka fogaan karaan sawir-qaadis waxayna kori karaan maadaama bakteeriyada heterotrophic ee mugdiga ku jirta, ay hagaajin karto nitrogen iyo kaarboon laba ogsaydh, soo saari karto haydarojiin, oo ay burburin karto isku-dhafka udgoonka (1-3). Si loo bixiyo tamar hababkan, iftiinku waa in si dhakhso leh oo hufan loogu beddelaa tamar kiimiko ah. Habkani wuxuu bilaabmaa marka isku-dhafka anteenada iftiinka-daboolka ah uu nuugo iftiinka oo uu u wareejiyo tamarta ku xayiran xarunta falcelinta (RC), taasoo bilaabaysa kala-soocidda dallacaadda (4-7). Cutubka aasaasiga ah ee sawir-qaadistu ee bakteeriyada sawir-qaadis guduudan waxay ka kooban tahay nooca 2 RC, oo ku wareegsan isku-dhafka goosashada iftiinka 1 (LH1), taasoo samaysa isku-dhafka asaasiga ah ee RC-LH1. LH1 waxaa sameeya tiro heterodimers αβ ah oo qaloocan, mid walbana wuxuu isku xiraa laba chlorophyll bakteeriya ah (BChl) molecules iyo hal ama laba carotenoids (8-12). Anteenada ugu fudud ee LH1 waxay ka kooban tahay 16 ama 17 αβ heterodimers oo ku wareegsan RC (9-13) wareeg xiran, laakiin isku-dhafka kale ee asaasiga ah, peptides-ka xuubka ayaa joojiya sii socoshada LH1 ee ku xeeran, taasoo kor u qaadaysa faafinta quinol/quinone ee u dhaxaysa RC iyo isku-dhafka cytochrome bc1 (11, 13-15). Geedka sawirka guduudan ee Rhodopseudomonas (Rps.) waa noole moodeel ah oo fahmi kara tamarta iyo wareejinta elektarooniga ee taageera sawir-qaadista. Qaab-dhismeedka kiristaalka ee ugu horreeya ee Rps. Qaabka isku-dhafka palustris RC-LH1 waa RC, oo ku wareegsan 15 wareeg oo heterodimeric LH1 ah, kuwaas oo ay kala go'do borotiin aan la garanayn oo loo yaqaan "Borotiin W" (14). Borotiin-W ayaa markii dambe loo aqoonsaday RPA4402, kaas oo ah borotiin 10.5kDa ah oo aan la garanayn oo leh saddex helices oo xuubka unugyada ah oo la saadaaliyay (TMH) (16). Waxaan soo jeedinaynaa in dib loogu magacaabo borotiinka rpa4402 ee hidde-sidaha W una beddelo pufW si uu ula jaanqaado magaca loo isticmaalo hiddo-sidayaasha RC-L, M (pufL, pufM) iyo LH1α, β (pufA, pufB). Waxaa xiiso leh, borotiin-W wuxuu ku jiraa oo keliya qiyaastii 10% RC-LH1, taasoo muujinaysa in Rps. palustris uu soo saaro laba isku-dhafan oo RC-LH1 oo kala duwan. Halkan, waxaan ku soo sheegaynaa qaab-dhismeedka cryo-EM (cryo-EM) ee xallinta sare leh ee laba isku-dhafan oo asaasi ah, mid leh borotiin W iyo 14 αβ heterodimers, kan kalena aan lahayn borotiin W iyo wareeg 16 Heterodimer LH1 oo xiran. Qaab-dhismeedkeenu wuxuu matalaa isbeddel tallaabo ah oo ku yimid fahamka isku-dhafka RC-LH1 ee Rps. palustris, sababtoo ah waxaan falanqeynay tirada isku-dhafan ee nooc kasta waxaanan haysannaa xal ku filan si aan si cad ugu qoondeyno peptide kasta iyo midabyada isku xiran iyo lipids-ka iyo quinones-ka la xiriira. Isbarbardhigga qaab-dhismeedkan wuxuu muujinayaa in saddexda borotiin ee TMH-W ee aan laga helin isku-dhafka kale ee RC-LH1 ilaa hadda ay abuuraan kanaal quinone ah si loo dedejiyo is-weydaarsiga quinone/quinolone. Tiro ka mid ah goobaha isku xidhka lipid iyo quinone ee la ilaaliyay ayaa la aqoonsaday, waxaanan shaaca ka qaadnay isbeddel cusub oo qaab-dhismeed ah ka dib isku-darka quinone iyo RC, kaas oo ku habboon photosystem II (PSII) RC ee noolaha phototrophic-ga oksijiinta leh. Natiijooyinkayagu waxay bixiyaan aragtiyo cusub oo ku saabsan kinetics-ka isku xidhka quinone/quinolone iyo is-weydaarsiga ee isku-dhafka asaasiga ah ee RC-LH1 ee bakteeriyada phototrophic-ga guduudan.
Si loo fududeeyo daraasad faahfaahsan oo ku saabsan labada isku-dhafan ee laga helo Rps. palustris, waxaan ku kala soocnaa RC-LH1 kasta hababka bayoolaji ahaan. Isku-dhafka borotiinka W-la'aanta ah (oo hadda loo yaqaan ΔpufW) ayaa laga nadiifiyay nooca aan lahayn hidda-wadaha pufW (16), waxaana la soo saari karaa hal isku-dhafan oo RC-LH1 ah oo keliya. Isku-dhafka borotiinka W-ka ah waxaa soo saara nooc. Borotiinka W ee noocaan waxaa wax laga beddelay iyadoo la adeegsanayo calaamadda His 10x ee C-terminus-kiisa, si isku-dhafka borotiinka W-ka ah loogu dari karo borotiinka ugu badan ee maqan iyadoo la joojinayo biraha. Isku-dhafka si wax ku ool ah ayaa loo kala saaraa (16) Affinity Chromatography (IMAC).
Sida ku cad Jaantuska 1, labada isku-dhafanba waxay ka kooban yihiin saddex unug oo RC ah (RC-L, RC-M iyo RC-H) oo ku wareegsan anteeno LH1 ah. Qaab-dhismeedka 2.80-A ee isku-dhafka aan lahayn borotiinka-W wuxuu muujinayaa 16 heterodimers αβ ah, iyagoo samaynaya wareeg LH1 oo xiran oo gebi ahaanba ku wareegsan RC, oo halkan loogu yeero isku-dhafka RC-LH116. Qaab-dhismeedka 2.65Å ee isku-dhafka borotiinka-W wuxuu leeyahay 14-heterodimer LH1 oo ay kala goysay borotiin-W, oo halkan loogu yeero RC-LH114-W.
(A iyo B) Muuqaalka dusha sare ee isku-dhafka. (C iyo D) Midabada isku xiran ee lagu muujiyo ulaha. (E iyo F) Isku-dhafka laga arkay dusha sare ee cytoplasmic waxay leeyihiin peptides iyo cutubyada LH1 ee lagu matalay kartoonnada, waxaana lagu tiriyaa saacad-wareegga farqiga borotiinka-W [oo la jaanqaadaya tirinta Rba. isku-dhafka sphaeroides (13)]. LH1-α, midabka cutubka borotiinka waa jaalle; LH1-β, midabka cutubka borotiinka waa buluug; borotiinka-W, borotiinku waa casaan; RC-H, waa cyan; RC-L, waa Liin; RC-M, magenta. Cofactors waxaa lagu matalaa ulaha, cagaarku wuxuu matalaa molecules BChl iyo BPh a, guduudku wuxuu matalaa carotenoids, jaallahana wuxuu matalaa molecules UQ10. (G iyo H) Aragtida weyn ee farqiga borotiinka-W ee gobolka u dhigma ee isku-dhafka RC-LH114-W (G) iyo isku-dhafka RC-LH116 (H). Cofactors-ka waxaa lagu soo bandhigayaa qaab buuxinta booska, quinone-ka chelated-ka ah waxaa lagu soo bandhigayaa buluug. Farqiga borotiinka-W waxaa lagu soo bandhigayaa xariiq buluug ah oo ku taal (G), godadka yaryar ee quinone/quinolol uu ku faafo giraanta LH116 waxaa lagu soo bandhigayaa xariiq madow oo ku taal (H).
Jaantuska 1 (A iyo B) wuxuu muujinayaa RC oo ay ku hareeraysan yihiin saf furan ama xiran oo ah heterodimers LH1αβ, mid walbana wuxuu isku xiraa laba BChl iyo hal carotenoid (Jaantuska 1, C iyo D). Daraasado hore ayaa muujiyay in Rps uu yahay isku-dhafka LH1. Wadada bayoolojiga ee spirulina xanthin, noocyadani waxay ka kooban yihiin dad isku dhafan oo carotenoids ah (17). Si kastaba ha ahaatee, spiropyrroxanthin waa carotenoid-ka ugu badan cufnaantiisuna waa mid ku filan. Sidaa darteed, waxaan doorannay inaan ku qaabeyno spiroxanthin dhammaan goobaha isku xidhka LH1. Polypeptides-ka alpha iyo beta waa TMH-yo keli ah oo leh gobollo dibadda ah oo xuubka gaaban ah (Jaantuska 1, A, B, E, iyo F). Inkasta oo aan la arkin cufnaanta 17 haraaga C-terminus, polypeptide-ka alpha waxaa laga soocay Met1 ilaa Ala46 labada isku-dhafan. β polypeptide waxaa laga dhimay Gly4 ilaa Tyr52 RC-LH116, iyo Ser5 ilaa Tyr52 RC-LH114-W. Cufnaanta 3 ama 4 N-terminal ama 13 C-terminal haraaga lama arag (Jaantuska S1). Falanqaynta cufnaanta cufnaanta ee isku-dhafka RC-LH1 ee laga diyaariyey nooca duurjoogta ah ayaa muujisay in gobolka maqan uu ahaa natiijada kala-goynta heterologous ee peptides-kan (Jaantuska S1 iyo S2). Qaab-dhismeedka N-terminal ee α-Met1 ayaa sidoo kale la arkay (f). Falanqaynta waxay muujisay in α-peptide uu ka kooban yahay haraaga fMet1 ilaa Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, β-peptide-na wuxuu ka kooban yahay haraaga Ser2 ilaa Ala53, kaas oo si wanaagsan ula jaanqaadaya khariidadda cufnaanta EM ee heerkulka hooseeya.
Isuduwidda α-His29 iyo β-His36 waxay BChls ka dhigtaa fool ka fool; αβ heterodimer kasta wuxuu la kulmaa deriskiisa si uu u sameeyo wareeg furan (RC-LH114-W) ama wareeg xiran (RC-LH116) oo ku wareegsan RC. Kala-soocidda midabka exciton-ka ee isku xiran (Jaantuska 1, C iyo D). Marka la barbardhigo kooxda 877 nm ee RC-LH114-W, isbeddelka cas ee nuugista 880 nm ee RC-LH116 waa 3 nm (Jaantuska 2A). Si kastaba ha ahaatee, spectrum-ka dichroism-ka ee wareegsan waa isku mid (Jaantuska 2B), taasoo muujinaysa in inkastoo uu jiro farqi cad oo u dhexeeya wareegyada furan iyo kuwa xiran, haddana deegaanka maxalliga ah ee BChls aad ayuu isugu eg yahay. Isbeddelka cas ee nuugista wuxuu noqon karaa natiijada dhaqdhaqaaqa kulaylka oo yaraada iyo xasilloonida kordhay ee wareegga xiran (18, 19), isbeddelka isku-xidhka midabka oo ay keento wareegga xiran (20, 21), ama isku-darka labadan saameynood (11).
(A) Noocyada nuugista ee Ultraviolet/muuqda/ku dhow infrared, kuwaas oo meelaha ugu sarreeya lagu calaamadeeyay midabyadooda u dhigma oo caadi loo dhigay heerka ugu sarreeya ee BPh ee 775 nm. (B) Noocyada wareegga ee dichroism-ka ayaa caadi loo beddelay nuugista BChl ee 805 nm. (C iyo D) Noocyada ΔA ee la xushay laga soo bilaabo noocyada nuugista ee waqtiga la xalliyay ee isku-dhafka RC-LH114-W (C) iyo isku-dhafka RC-LH116 (D). Si loo helo isbarbardhig wanaagsan, dhammaan noocyada waxaa loo caadiyeeyay ∆A ee −A 0.2 ps. (E) Heerka oksaydhka cytochrome c2 ka dib shucaaca iyadoo ay joogaan fiirsashooyin kala duwan oo UQ2 ah (fiiri Jaantuska S8 si aad u hesho xog cayriin ah). (F) Unugyada lagu koriyo iftiinka hooseeya, dhexdhexaadka ah ama sare (10, 30 ama 300μMm-2 s-1, siday u kala horreeyaan), qaybaha borotiinka W iyo RC-L ee isku-dhafka la nadiifiyey iyo saamiga xuubka kala go'ay. Go'aami heerka borotiinka iyadoo la adeegsanayo electrophoresis jel SDS-polyacrylamide iyo immunoassay (fiiri Jaantuska S9 si aad u hesho xog cayriin ah). Go'aami saamiga marka loo eego isku-dhafka RC-LH114-W ee la nadiifiyey. Saamiga stoichiometric ee RC-L ilaa borotiinka-W ee isku-dhafka waa 1:1.
BChls-ka booska 1aad ee wareegga αβ14 ee RC-LH114-W ee aan habboonayn (Jaantuska 1, A, C, iyo E) waxay u dhow yihiin deeq-bixiyaha koowaad ee RC (P) 6.8Å marka loo eego BChls-ka u dhigma ee RC-LH116 (Jaantuska 1, B, D, iyo F, iyo Jaantuska S3); si kastaba ha ahaatee, kinetics-ka nuugista ku-meel-gaarka ah ee labada isku-dhafan waxay muujinayaan in RC-LH114-W iyo RC-LH116, joogtada wakhtiga wareejinta tamarta kicinta ee ka imanaya LH1 ilaa RC ay yihiin 40 ±4 iyo 44±3 ps (Jaantuska 2). , C iyo D, Jaantuska S4 iyo Shaxda S2). Sidoo kale ma jiro farqi weyn oo ku yimid wareejinta elektaroonigga ah ee gudaha RC (Jaantuska S5 iyo qoraalka dheeraadka ah ee la xiriira). Waxaan tuhunsannahay in isku-xidhka dhow ee wakhtiga wareejinta tamarta ee u dhexeeya LH1 iyo RC-P ay sabab u tahay masaafada isku midka ah, xagasha iyo tamarta suurtagalka ah ee inta badan BChl ee labada wareeg ee LH1. Waxay u muuqataa in sahaminta qaabka tamarta LH1 si loo gaaro masaafada ugu yar aysan ka dhaqso badanayn wareejinta tamarta tooska ah ee laga soo bilaabo goobaha aan fiicnayn ilaa RC. Wareegga furan ee LH1 ee RC-LH114-W ayaa sidoo kale laga yaabaa inuu maro dhaqdhaqaaq kuleyl oo aan muhiim ahayn xaaladaha heerkulka hooseeya si loo falanqeeyo qaab-dhismeedka, waxaana jira qaab-dhismeedka giraanta αβ14 oo dheer heerkulka qolka laga bilaabo masaafada midabaynta ee βBChls ee booska RC 1.
Isku-dhafka RC-LH116 wuxuu ka kooban yahay 32 BChls iyo 16 carotenoids, qaab-dhismeedkiisa guudna waa la mid yahay kan laga helay Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Borotiinka Xogta Bangiga (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 nooc (PDB ID 7C9R) (12) iyo algae cagaaran (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Ka dib isku-dubaridka, waxaa la arkay kaliya kala-duwanaansho yar oo ku jira boosaska heterodimers-ka αβ, gaar ahaan 1-5, 15, iyo 16 (Jaantuska S6). Joogitaanka borotiinka-W wuxuu saameyn weyn ku leeyahay qaab-dhismeedka LH1. Saddexdiisa TMH waxaa ku xiran wareegyo gaaban, iyadoo N-terminal uu ku yaal dhinaca lumen ee isku-dhafka iyo C-terminal uu ku yaal dhinaca cytoplasmic (Jaantusyada 1A iyo 3, A ilaa D). Borotiin-W inta badan waa hydrophobic (Jaantuska 3B), TMH2 iyo TMH3 waxay la falgalaan LH1αβ-14 si ay u sameeyaan dusha sare ee xuubka (Jaantuska 3, B iyo E ilaa G). Isdhexgalka wuxuu inta badan ka kooban yahay haraaga Phe, Leu iyo Val ee gobolka xuubka. Haraagaan waxaa lagu dhejiyay asiidhyada amino-ka hydrophobic iyo midabyada αβ-14. Haraaga qaar ee polar ayaa sidoo kale gacan ka geysta isdhexgalka, oo ay ku jiraan xiriirka hydrogen ee u dhexeeya W-Thr68 iyo β-Trp42 ee dusha sare ee godka adag (Jaantuska 3, F iyo G). Dusha sare ee cytoplasm-ka, Gln34 waxay ku xigtaa kooxda keto ee carotenoids-ka αβ-14. Intaa waxaa dheer, molecule-ka n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) ayaa la xalliyay, dabada hydrophobic-kana waxay u fidday isku xirka u dhexeeya borotiinka-W iyo αβ-14, dabada lipid-kana waxaa laga yaabaa inay ku taal jirka. Waxaan sidoo kale ogaanay in gobollada xallinta C-terminal ee borotiinka W iyo RCH ay aad isugu dhow yihiin, laakiin aysan ku jirin baaxadda sameynta isdhexgalka gaarka ah (Jaantuska 1, A iyo E). Si kastaba ha ahaatee, waxaa jiri kara isdhexgal ku yimaada asiidhyada amino-terminal-ka ee aan la xallin ee labada borotiin, kuwaas oo laga yaabo inay bixiyaan hab lagu qoro borotiinka-W inta lagu jiro isu imaatinka isku-dhafka RC-LH114-W.
(A) Borotiin-W, oo wajahaya is-dhexgalka LH1αβ14 qaab kartoon ah, wuxuu leeyahay silsilad dhinac u eg usha (casaan), oo lagu soo bandhigay qayb ka mid ah jaantuska awoodda elektrostatic-ka (dusha sare ee cawlan oo hufan oo leh heer qaabaysan oo ah 0.13). (B) Borotiin-W oo lagu matalo dusha midab leh oo hydrophobic ah. Meelaha polar iyo kuwa lagu dallacay waxaa lagu soo bandhigay cyan, meelaha hydrophobic waxaa lagu soo bandhigay caddaan, meelaha hydrophobic-ka ee xooggan waxaa lagu soo bandhigay oranji. (C iyo D) Borotiin-W oo lagu matalay kartoon, jihadiisu waa la mid tahay sida (A) (C), waxaana lagu wareejiyay 180° (D). Sida ku xusan booska taxanaha, haraaga la kala saari karo waxay qaataan qaab midab qaanso roobaad ah, halkaas oo N-terminal uu yahay buluug C-terminal-kuna uu yahay casaan. (E) Borotiin-W oo leh isla aragtida (A), haraaga isku-xirka borotiinka-W:LH1 waxaa lagu matalay ulaha leh calaamado ku lifaaqan. (F) Borotiin-W waxaa lagu wareejiyaa 90° marka loo eego (E) iyo LH1αβ14 ee matalaadda kartoonka, iyo marka loo eego haraaga is-dhexgalka ee matalaadda baarka. Haraaga dul-dulleeya ee ka imanaya beta polypeptide ayaa lagu calaamadeeyay. Cofactor-ka waxaa lagu muujiyay baar u dhigma midabka Sawirka 1, β-DDM-kii burburay waxaa lagu muujiyay cawl, oksijiintana waxaa lagu muujiyay casaan. (G) Aragtida (F) waxaa lagu wareejiyay 180°, iyadoo haraaga muuqda ee polypeptide-ka alpha ee calaamadaysan.
Borotiin-W wuxuu beddelaa heterodimer-ka αβ (kan 15aad ee Jaantuska 1F), taasoo ka hortagaysa xidhitaanka wareegga iyo janjeedhka saddexda heterodimer-ka αβ ee ugu horreeya. Waxaa la arkay in xagasha ugu badan ee heterodimer-ka αβ-1 ee ugu horreysa marka loo eego filimka caadiga ah ay ahayd 25° ilaa 29° (Jaantuska 1, A iyo E), kaas oo lagu sameeyay janjeedhka 2° ilaa 8° ee αβ-1 ee RC A isbarbardhig fiiqan-LH116 (Jaantuska 1, B iyo F). Heterodimer-ka labaad iyo saddexaad waxay u janjeedhsan yihiin 12° ilaa 22° iyo 5° ilaa 10°, siday u kala horreeyaan. Sababtoo ah caqabadda steric ee RC, janjeedhka αβ-1 kuma jiraan lammaane labaad ee αβ (kaas oo u dhigma αβ-ka 16aad ee Jaantuska 1F), sidaas darteedna waxay samaynaysaa farqi cad oo ku jira giraanta LH1 (Jaantuska 1, A iyo E). Sababtoo ah la'aanta laba heterodimers oo αβ ah, oo ay weheliso luminta afar BChl iyo laba carotenoids, midna carotenoids kuma xidhna qaybta αβ-1 ee qalloocan, taasoo keentay giraan LH114-W ah oo ka kooban 13 carotenoids Khudradeed iyo 28 BChls. Qiyaasaha xallinta maxalliga ah ee labada isku-dhafan ee gobollada αβ1 ilaa 7 ayaa ka hooseeya kuwa kale ee wareegga LH1, taas oo laga yaabo inay ka tarjunto dabacsanaanta ku jirta qaybta LH1 ee ku xigta goobta RC QB (Jaantuska 4).
Sawirada RC-LH114-W (A iyo B) iyo RC-LH116 (C iyo D) waxaa laga soo bandhigay isla muuqaalka sare/dhinaca (A iyo B) (A iyo C) iyo dusha sare ee godka ee Jaantuska 1. (B iyo D). Furayaasha midabka leh waxaa lagu muujiyay dhanka midig.
Isku-dhafka asaasiga ah ee kale ee astaamaha leh saamiga stoichiometric ee 1:14 waa Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Si kastaba ha ahaatee, borotiinka W iyo PufX ma laha isku-mid muuqda, waxayna leeyihiin saameyn weyn oo ku saabsan qaab-dhismeedkooda LH1. PufX waa hal TMH oo leh domain cytoplasmic N-terminal ah oo la falgala dhinaca cytoplasmic ee qaybta hoose ee RC-H (13) meel u dhiganta Rps. palustris LH116αβ-16. PufX wuxuu abuuraa kanaal loogu talagalay is-weydaarsiga quinone/quinolone ee u dhexeeya RC-LH1 iyo isku-dhafka cytochrome bcl wuxuuna ku jiraa dhammaan isku-dhafka asaasiga ah ee Rba. sphaeroides (13). In kasta oo is-dhexgalka monomer-monomer uu ku jiro Rba. Dimer-ka sphaeroides-ka RC-LH1-PufX wuxuu ku yaal booska isku xidhka borotiinka W ee RC-LH114-W, farqiga uu kiciyay PufX iyo borotiinka-W wuxuu ku yaal boos u dhigma (Jaantuska S7A). Farqiga RC-LH114-W sidoo kale wuxuu la jaan qaadayaa kanaalka quinone-ka ee mala-awaalka ah (8) ee Pseudomonas rosea LH1, kaas oo ay sameeyaan peptides aan la xiriirin borotiinka W ama PufX (Jaantuska S7B). Intaa waxaa dheer, kanaalka quinone-ka ee Blc. LH1-ka cagaarka ah ee emerald-ka ah ee lagu sameeyay ka saarista hal qayb oo γ ah (7) wuxuu ku yaal boos la mid ah (Jaantuska S7C). Inkasta oo ay dhexdhexaadinayaan borotiinno kala duwan, muuqaalka kanaallada quinone/quinolol ee boos caadi ah oo ku jira isku-dhafka RC-LH1 wuxuu u muuqdaa inuu yahay tusaale isbeddel isku dhafan, taasoo muujinaysa in farqiga uu abuuray borotiinka W uu u dhaqmi karo sidii kanaalka quinone.
Farqiga u dhexeeya wareegga LH114-W wuxuu u oggolaanayaa sameynta gobol xuubka joogtada ah oo u dhexeeya booska gudaha ee isku-dhafka RC-LH114-W iyo xuubka guud (Jaantuska 1G), halkii laga xiri lahaa labada qaybood iyada oo loo marayo dalool borotiin ah sida borotiinnada. Isku-dhafka RC-LH116 wuxuu la mid yahay isku-dhafka irbadda u eg ee xiran (22) (Jaantuska 1H). Maadaama faafitaanka quinone ee xuubka uu ka dhakhso badan yahay faafitaanka kanaalka borotiinka ee cidhiidhiga ah, wareegga LH114-W ee furan wuxuu u oggolaan karaa isbeddel RC oo ka dhakhso badan wareegga LH116 ee xiran, faafinta quinone ee RC-na waxaa laga yaabaa inay aad u xaddidan tahay. Si loo tijaabiyo in borotiin W uu saameeyo beddelka quinones iyada oo loo marayo RC, waxaan sameynay tijaabo oksaydheynta cytochrome oo ku saabsan uruurinta gaarka ah ee ubiquinone 2 (UQ2) (analog ah UQ10 dabiiciga ah oo leh dabada isoprene gaaban) (Jaantuska 2E). Inkasta oo joogitaanka quinone-ka chelated uu caqabad ku yahay go'aaminta saxda ah ee joogtada Michaelis ee muuqata (RC-LH114-W iyo RC-LH116 waxay ku habboon yihiin 0.2±0.1μM iyo 0.5±0.2μM, siday u kala horreeyaan), heerka ugu badan ee RC-LH114-W (4.6±0.2 e-RC-1 s-1) waa 28±5% ka weyn RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Markii hore waxaan ku qiyaasnay ​​in borotiin-W uu ku jiro qiyaastii 10% isku-dhafka asaasiga ah (16); halkan, heerarka joogitaanka unugyada koritaanka iftiinka hooseeya, iftiinka dhexdhexaadka ah, iyo kuwa iftiinka sare leh waa 15±0.6%, 11±1% iyo 0.9±0.5, siday u kala horreeyaan % (Jaantuska 2F). Isbarbardhigga tirada ee spectrometry-ka cufka ayaa muujiyay in ku darista calaamadda histidine aysan yareyn tirada qaraabada ah ee borotiinka-W marka la barbar dhigo noocyada nooca duurjoogta ah (P = 0.59), sidaa darteed heerarkani ma aha wax soo saar borotiin-W oo wax laga beddelay (Jaantuska S10). Si kastaba ha ahaatee, joogitaanka hooseeya ee borotiinka-W ee isku-dhafka RC-LH1 ayaa u oggolaan kara qaar ka mid ah RC-yada inay ku rogaan heer degdeg ah, taasoo yareynaysa is-weydaarsiga quinone/quinolone ee gaabiska ah ee isku-dhafka RC-LH116. Waxaan ogaanay in heerka joogitaanka iftiinka sare uu la jaanqaadi karo xogta dhawaan la soo saaray ee transcriptomics, taas oo tilmaamaysa in muujinta hidda-wadaha pufW ay korodho iftiinka xooggan (Jaantuska S11) (23). Farqiga u dhexeeya qoraalka pufW iyo ku darista borotiinka-W ee isku-dhafka RC-LH1 waa mid jahawareer leh waxaana laga yaabaa inay ka tarjunto nidaaminta adag ee borotiinka.
RC-LH114-W, 6 cardiolipin (CDL), 7 phosphatidylcholine (POPC), 1 phosphatidylglycerol (POPG) iyo 29 β-DDM molecules ayaa loo qoondeeyay oo lagu qaabeeyey 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs iyo 12 βDDMs. RC-LH116 (Jaantuska 5, A iyo B). Labadan qaab-dhismeed, CDL waxay ku dhowdahay inay ku taal dhinaca cytoplasmic ee isku-dhafka, halka POPC, POPG iyo β-DDM ay inta badan ku yaalliin dhinaca iftiinka. Laba molecules oo lipid iyo saabuun ah ayaa lagu go'doomiyay gobolka αβ-1 ilaa αβ-6 ee isku-dhafka RC-LH114-W (Jaantuska 5A), shanna waxaa lagu go'doomiyay gobolka u dhigma ee RC-LH116 (Jaantuska 5B). Dufanno badan ayaa laga helay dhinaca kale ee isku-dhafka, inta badan CDL, oo ​​ku ururay inta u dhaxaysa RC iyo αβ-7 ilaa αβ-13 (Jaantuska 5, A iyo B). Dufanno kale oo qaab-dhismeed ahaan la xalliyay iyo saabuunno ayaa ku yaal meel ka baxsan giraanta LH1, silsiladaha acyl ee si fiican loo xalliyayna waxay u dhexeeyaan qaybaha hoose ee LH1, oo si ku-meel-gaar ah loogu magacaabay β-DDM ee RC-LH114-W, waxaana lagu qeexay β-DDM isku-darka RC A ee β-DDM iyo POPC-LH116. Jagooyinka isku midka ah ee dufannada chelating iyo saabuunta ee qaab-dhismeedkeenna waxay muujinayaan inay yihiin goobo isku xiran oo jir ahaaneed khuseeya (Jaantuska S12A). Jagooyinka molecules ee u dhigma ee Tch sidoo kale waxay leeyihiin isku-dheellitirnaan wanaagsan. Jilicsan iyo Trv. Xabadaha 970 RC-LH1s (Jaantuska S12, B ilaa E) (9, 12) iyo haraaga isku xidhka haydarojiin ee kooxda madaxa dufanka ayaa muujiyay ilaalin wanaagsan oo ku jirta isku xidhka taxanaha (Jaantuska S13), taasoo muujinaysa in CDL la ilaaliyay oo ku xidhan RC (24), goobahan laga yaabo in lagu ilaaliyo isku-dhafka RC-LH1.
(A iyo B) peptide-yada RC-LH114-W (A) iyo RC-LH116 (B) waxaa lagu matalaa kartoonno, midabyadana waxaa lagu matalaa ulo, iyadoo la adeegsanayo qaabka midabka ee Jaantuska 1. Lipids-ka waxaa lagu muujiyay casaan, saabuuntana waxaa lagu muujiyay cawl. UQ oo ku xiran goobaha RC QA iyo QB waa jaalle, halka UQ-ga go'doonsan uu yahay buluug. (C iyo D) Aragtiyo isku mid ah (A) iyo (B), oo dufannada laga saaray. (E ilaa G) Aragti ballaaran oo Q1(E), Q2(F) iyo Q3(G) ah oo ka yimid RC-LH116, oo leh silsilado dhinac ah oo is saameeya. Xidhmooyinka haydarojiin waxaa lagu muujiyay xariiqyo madow oo jajaban.
RC-LH116, RC QA iyo QB UQ, kuwaas oo ka qayb qaata wareejinta elektarooniga ee habka kala soocida dallacaadda, ayaa lagu kala firdhiyaa goobaha ay ku xidhmaan. Si kastaba ha ahaatee, RC-LH114-W, quinone-ka QB lama xallin waxaana si faahfaahsan looga hadli doonaa hoos. Marka lagu daro quinone-yada QA iyo QB, laba molecules UQ oo chelated ah (oo ku yaal inta u dhaxaysa giraanta RC iyo LH1) ayaa loo qoondeeyay qaab-dhismeedka RC-LH114-W iyadoo loo eegayo kooxaha madaxa ee si fiican loo xalliyay (oo ku yaal Q1 iyo Q2, siday u kala horreeyaan). Jaantuska 5C). Laba cutub oo isoprene ah ayaa loo qoondeeyay Q1, khariidadda cufnaantana waxay xallisaa 10ka dabo ee isoprene ee dhammaystiran ee Q2. Qaab-dhismeedka RC-LH116, saddex molecules UQ10 oo chelated ah (Q1 ilaa Q3, Jaantuska 5D) ayaa la xalliyay, dhammaan molecules-kuna waxay leeyihiin cufnaan cad oo ku baahsan dabada (Jaantuska 5, D ilaa G). Labada qaab-dhismeed, boosaska kooxaha madaxa quinone ee Q1 iyo Q2 waxay leeyihiin isku dheelitirnaan aad u fiican (Jaantuska S12F), waxayna la falgalaan oo keliya RC. Q1 waxay ku taal albaabka farqiga W ee RC-LH114-W (Jaantuska 1G iyo 5, C, D iyo E), Q2-na waxay ku taal meel u dhow goobta isku xidhka QB (Jaantuska 5, C, D) iyo F). Hadhaaga L-Trp143 iyo L-Trp269 ee la ilaaliyay aad bay ugu dhow yihiin Q1 iyo Q2 waxayna bixiyaan isdhexgal suurtagal ah oo π-istaag ah (Jaantuska 5, E iyo F, iyo Sawirka S12). L-Gln88, 3.0 Å oo ka imanaya oksijiinta fog ee Q1, waxay bixisaa xiriir haydarojiin oo xooggan (Jaantuska 5E); hadhaagani wuxuu ku jiraa dhammaan RC-yada marka laga reebo xiriirka ugu fog (Jaantuska S13). L-Ser91 si taxaddar leh ayaa loogu beddelay Thr inta badan RC-yada kale (Jaantuska S13), waa 3.8 Angstroms oo ka imanaya oksijiinta methyl ee Q1, waxayna bixin kartaa xidhmo haydarojiin oo daciif ah (Jaantuska 5E). Q3 uma muuqato inay leedahay isdhexgal gaar ah, laakiin waxay ku taal gobolka hydrophobic ee u dhexeeya qaybta RC-M iyo qaybta LH1-α ee 5 ilaa 6 (Jaantuska 5, D iyo G). Q1, Q2 iyo Q3 ama quinones-ka chelated ee u dhow ayaa sidoo kale lagu xalliyay Tch. Gentle, Trv. Strain 970 iyo Blc. Qaab-dhismeedka iris (9, 10, 12) wuxuu tilmaamayaa goob xidhitaan quinone ah oo la ilaaliyo oo ku taal isku-dhafka RC-LH1 (Jaantuska S12G). Shanta UQ ee jajaban ee ku jira RC-LH116 waxay si fiican ula jaanqaadayaan 5.8±0.7 ee isku-dhafan kasta oo lagu go'aamiyay koromatografiga dareeraha ee waxqabadka sare leh (HPLC), halka saddexda UQ ee jajaban ee ku jira RC-LH114-W ay ka hooseeyaan Qiimaha la cabbiray ee 6.2±0.3 (Jaantuska S14) wuxuu tilmaamayaa in ay jiraan molecules UQ oo aan la xallin oo ku jira qaab-dhismeedka.
Polypeptide-yada L iyo M ee beenta ah mid walba wuxuu ka kooban yahay shan TMHs waxayna sameeyaan heterodimer kaas oo isku daraya hal dimer BChl ah, laba monomers BChl ah, laba monomers bacteriophage (BPh), iyo hal bir aan Heme ahayn iyo hal ama laba molecules UQ10 ah. Iyada oo loo marayo joogitaanka xidhmooyinka haydarojiin ee kooxda ketone ee terminalka iyo ururinta la yaqaan ee Rps, carotenoids waxaa lagu daray M-subunit, kaas oo loogu magac daray cis-3,4-dehydroorhodopin. Noocyada (25). Qaybta xuubka dibadda ee RC-H waxaa ku xiran xuubka hal TMH. Qaab-dhismeedka RC guud wuxuu la mid yahay saddexda unug ee RC ee noocyada la xiriira (sida Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Macrocycles-ka BChl iyo BPh, laf-dhabarta carotenoid iyo birta aan heme ahayn ayaa isku dul fadhiya xadka xallinta ee qaab-dhismeedkan, sida kooxda madaxa UQ10 ee goobta QA iyo quinone QB ee RC-LH116 (Jaantuska S15).
Helitaanka laba qaab-dhismeed oo RC ah oo leh heerarka kala duwan ee degitaanka goobta QB waxay bixisaa fursad cusub oo lagu baaro isbeddellada qaab-dhismeedka ee joogtada ah ee la socda isku xidhka quinone-ka QB. Dhismaha RC-LH116, quinone-ka QB wuxuu ku yaal booska "ugu dhow" ee si buuxda u xiran (26), laakiin kala-soocidda RC-LH114-W ma laha quinone-ka QB. Ma jiro quinone-ka QB ee RC-LH114-W, taas oo la yaab leh sababtoo ah isku-dhafka ayaa firfircoon, in ka badan isku-dhafka RC-LH116 oo leh quinone-ka QB ee qaab-dhismeedka lagu xalliyay. Inkasta oo labada giraan ee LH1 ay qiyaas ahaan lix quinones yihiin, shan ayaa si qaab-dhismeed ahaan loo xalliyay giraanta RC-LH116 ee xiran, halka saddex keliya ay si qaab-dhismeed ahaan u xaddidan yihiin giraanta RC-LH114-W ee furan. Qalalaasahan qaab-dhismeedka ee kordhay wuxuu ka tarjumayaa beddelka degdegga ah ee goobaha QB-ga RC-LH114-W, kinetics-ka quinone-ka ee degdega ah ee dhismaha, iyo suurtagalnimada sii kordheysa ee ka gudubka wareegga LH1. Waxaan soo jeedinaynaa in la'aanta UQ ee goobta RC QB ee RC-LH114-W ay noqon karto natiijada isku-dhafan aad u adag oo firfircoon, iyo goobta QB ee RC-LH114-W ayaa isla markiiba la qaboojiyey iyadoo UQ-gu soo wareegayo. Marxaladda gaarka ah (albaabka laga galo goobta QB waa la xiray) waxay ka tarjumaysaa qaab-dhismeedka hawshan.
Haddii aan la helin QB, wareegga la socda ee L-Phe217 ilaa meel aan la jaan qaadi karin isku xidhka UQ10, sababtoo ah waxay sababi doontaa isku dhac meeleed oo leh cutubka isoprene ee ugu horreeya ee dabada (Jaantuska 6A). Intaa waxaa dheer, isbeddellada qaab-dhismeedka ee muuqda ayaa muuqda, gaar ahaan helix de (helix gaaban oo ku jira wareegga u dhexeeya TMH D iyo E) halkaas oo L-Phe217 loo wareejiyay jeebka isku xidhka QB iyo wareegga L-Tyr223 (Jaantuska 6A) Si loo jebiyo xiriirka haydarojiinta qaab-dhismeedka M-Asp45 loona xiro albaabka goobta isku xidhka QB (Jaantuska 6B). Helix de wuxuu ku wareegayaa saldhiggiisa, Cα ee L-Ser209 waxaa loo wareejiyay 0.33Å, halka L-Val221Cα loo wareejiyay 3.52Å. Ma jiraan isbeddello la arki karo oo ku jira TMH D iyo E, kuwaas oo aan laga gudbi karin labada qaab-dhismeedba (Jaantuska 6A). Inta aan ognahay, kani waa qaab-dhismeedka ugu horreeya ee RC-ga dabiiciga ah ee xira goobta QB. Isbarbardhigga qaab-dhismeedka dhammaystiran (QB-ku-xidhan) wuxuu muujinayaa in ka hor inta aan la dhimin quinone-ka, loo baahan yahay isbeddel qaab-dhismeed si uu u galo quinone-ka. L-Phe217 wuxuu wareegayaa si uu u sameeyo is-dhexgal π-istaag ah oo lala yeesho kooxda madaxa quinone, helix-kuna wuxuu u wareegayaa dibadda, taasoo u oggolaanaysa qalfoofka L-Gly222 iyo silsiladda dhinaca ee L-Tyr223 inay sameeyaan shabakad isku xidhka haydarojiin oo leh qaab-dhismeed isku xidhka haydarojiin oo deggan (Jaantuska 6, A iyo C).
(A) Kartoon is dulsaaran oo ah hologram (silsilad L, silsilad oranji/M, magenta) iyo qaab-dhismeedka apo (cawlan), kaas oo haraaga muhiimka ah lagu soo bandhigay qaab u eg ul. UQ10 waxaa lagu matalaa baar jaalle ah. Xariiqda dhibcaha leh waxay muujinaysaa isku xidhka haydarojiinta ee ka samaysan qaab-dhismeedka oo dhan. (B iyo C) Matalaadda dusha sare ee apolipoprotein iyo qaab-dhismeedka giraanta oo dhan, iyadoo iftiiminaysa oksijiinta silsiladda dhinaca ee L-Phe217 ee buluugga ah iyo L-Tyr223 ee casaanka ah, siday u kala horreeyaan. Qaybta hoose ee L waa oranji; qaybaha hoose ee M iyo H lama midabayn. (D iyo E) Apolipoprotein (D) iyo dhammaan (E) goobaha RC QB [midabka (A) siday u kala horreeyaan] iyo Thermophilus thermophilus PSII (cagaar, buluug oo leh quinone balaastig ah; PDB ID: 3WU2) Isku toosi (58).
Si lama filaan ah, inkastoo dhowr qaab-dhismeed oo RC-yada aan lahayn QB-ga oo aan lahayn LH1 la heli karo, isbeddellada qaab-dhismeedka ee lagu arkay daraasaddan hore looma soo sheegin. Kuwaas waxaa ka mid ah qaab-dhismeedka dhimista QB ee ka yimid Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) iyo Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), kuwaas oo dhammaantood ku dhawaad ​​​​isku mid yihiin qaab-dhismeedkooda guud ee QB. Kormeerka dhow ee 3PRC wuxuu shaaca ka qaaday in molecules-ka saabuunta LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ay ku xiran yihiin albaabka booska QB, taasoo ka hortagi karta dib-u-habaynta qaab-dhismeedka xiran. Inkasta oo LDAO uusan ku burburin isla booska 1EYS ama 1OGV, RC-yadan waxaa lagu diyaariyey isla saabuunta sidaas darteedna waxay soo saari karaan saameyn isku mid ah. Qaab-dhismeedka kiristaalka ee Rba. Sphaeroides RC oo la isku daray cytochrome c2 (PDB ID: 1L9B) ayaa sidoo kale u muuqata inay leedahay goob QB ah oo xiran. Si kastaba ha ahaatee, kiiskan, gobolka N-terminal ee polypeptide-ka RC-M (oo la falgalaya goobta isku xidhka QB iyada oo loo marayo isku xidhka H ee haraaga Tyr ee helix-ka Q) wuxuu qaataa qaab-dhismeed aan dabiici ahayn, isbeddelka qaab-dhismeedka QB-na si dheeraad ah looma sahamin (30). Waxa hubaal ah ayaa ah inaanan arag noocan oo kale ah isbeddelka polypeptide-ka M ee qaab-dhismeedka RC-LH114-W, kaas oo ku dhawaad ​​​​la mid ah gobolka N-terminal ee RC-LH116 RC. Sidoo kale waa in la ogaadaa in ka dib markii la tirtiray anteenada LH1 ee ku salaysan saabuunta, RC-yada apolipoprotein ee PDB la xalliyay, taas oo meesha ka saartay barkadaha quinone ee gudaha iyo lipids-ka ee farqiga u dhexeeya RC iyo dusha sare ee gudaha ee giraanta LH1 ee ku wareegsan (31, 32). RC wali wuu shaqeynayaa sababtoo ah waxay haysaa dhammaan walxaha isku-dhafan, marka laga reebo quinone-ka QB ee la kala furfuri karo, kaas oo aan xasilloonayn oo inta badan lumiya inta lagu jiro habka diyaarinta (33). Intaa waxaa dheer, waxaa la ogyahay in ka saarista LH1 iyo lipids-ka dabiiciga ah ee wareegga ah ee RC ay saameyn ku yeelan karto shaqooyinka, sida cimriga gaaban ee xaaladda P+QB-ga ee kala go'an (31, 34, 35). Sidaa darteed, waxaan qiyaaseynaa in jiritaanka giraanta LH1 ee maxalliga ah ee ku wareegsan RC ay ilaalin karto goobta QB ee "xiran", taasoo ilaalinaysa deegaanka maxalliga ah ee u dhow QB.
In kasta oo apolipoprotein (aan lahayn quinone QB) iyo qaab-dhismeedka oo dhammaystiran ay matalaan laba sawir oo keliya oo ku saabsan wareegga goobta QB, halkii ay ka ahaan lahaayeen taxane dhacdooyin ah, waxaa jira tilmaamo muujinaya in xidhitaanka la furi karo si looga hortago dib-u-xidhka iyadoo la adeegsanayo hydroquinone. Si loo joojiyo joojinta substrate-ka. Isdhexgalka quinolol iyo quinone oo u dhow goobta QB ee apolipoprotein way kala duwanaan karaan, taasoo horseedaysa diidmadeeda RC. Waxaa muddo dheer la soo jeediyay in isbeddellada qaab-dhismeedka ay door ka ciyaaraan xidhitaanka iyo yaraynta quinones. Awoodda RC-yada la qaboojiyey si loo yareeyo quinones ka dib la qabsiga mugdiga ah waa mid daciif ah (36); Sawirka raajada X-ray wuxuu muujinayaa in dhaawacani uu sabab u yahay quinones QB oo ku xayiran qaab "fog" oo qiyaastii 4.5 Å laga bilaabo booska firfircoon ee u dhow (26), 37). Waxaan soo jeedinaynaa in qaab-dhismeedkan isku xidhka fog uu yahay sawir-gacmeed xaaladda dhexe ee u dhaxaysa apolipoprotein iyo qaab-dhismeedka giraanta oo buuxa, kaas oo raacaya isdhexgalka bilowga ah ee quinone iyo furitaanka goobta QB.
Nooca II RC ee laga helo isku-dhafka PSII ee bakteeriyada sawir-qaadista qaarkood iyo cyanobacteria, algae iyo dhirta waxay leedahay ilaalin qaab-dhismeed iyo mid shaqeyneed (38). Isku-dubaridka qaab-dhismeedka ee lagu muujiyay Jaantuska 6 (D iyo E) wuxuu xoogga saarayaa isku- ekaanshaha u dhexeeya PSII RCs iyo goobta QB ee isku-dhafka bakteeriyada RC. Isbarbardhiggani wuxuu muddo dheer ahaa qaab lagu baranayo nidaamyada isku xiran ee isku-xidhka iyo dhimista quinone. Daabacaadihii hore waxay soo jeediyeen in isbeddellada qaab-dhismeedka ay la socdaan dhimista PSII ee quinones (39, 40). Sidaa darteed, marka la eego ilaalinta isbeddelka ee RC, habkan isku xidhka ee aan hore loo arag ayaa sidoo kale laga yaabaa inuu khuseeyo goobta QB ee PSII RC ee dhirta sawir-qaadista oksijiinta leh.
Rps ΔpufW (tirtirka pufW ee aan calaamadda lahayn) iyo PufW-His (C-terminal 10x His-called protein-W oo laga soo xigtay noocyada pufW locus ee dabiiciga ah). palustris CGA009 waxaa lagu sharraxay shaqadeennii hore (16). Noocyadan iyo waalidka nooca duurjoogta ah ee isogenic-ka ah ayaa laga soo saaray qaboojiyaha iyadoo lagu dhejiyay tiro yar oo unugyo ah PYE (5 g litir kasta -1) (lagu kaydiyay LB at -80 °C, oo ka kooban 50% (w/v) protein glycerol) ah, soosaarka khamiirka iyo succinate) agar [1.5% (w/v)] saxan. Saxanka waxaa lagu kululeeyay habeenkii mugdiga heerkulka qolka xaaladaha anaerobic, ka dibna waxaa lagu iftiimiyay iftiin cad (~50 μmolm-2 s-1) oo ay bixisay nalalka halogen ee OSRAM 116-W (RS Components, UK) muddo 3 ilaa 5 maalmood ah ilaa hal deegaan uu soo muuqdo. Hal gumeysi ayaa loo isticmaalay in lagu tallaalo 10 ml oo M22+ dhexdhexaad ah (41) oo lagu daray 0.1% (w/v) asiidhyada casamino (oo hadda loo yaqaan M22). Dhaqanka waxaa lagu beeray xaalado oksijiin hooseeya mugdiga 34°C iyadoo la ruxayo 180 rpm muddo 48 saacadood ah, ka dibna 70 ml oo dhaqanka ah ayaa lagu tallaalay xaalado isku mid ah muddo 24 saacadood ah. Dhaqan nus-aerobic ah oo leh mug 1 ml ah ayaa loo isticmaalaa in lagu tallaalo 30 ml oo M22 dhexdhexaad ah dhalo galaas oo hufan oo 30 ml ah oo isku dheggan oo caalami ah waxaana lagu shubay dareen kacsanaan ah (~50μmolm-2 s-1) muddo 48 saacadood ah iyadoo la adeegsanayo xoog birlab oo nadiif ah oo usha kicinta ah. Kadib 30 ml oo dhaqanka ah ayaa lagu tallaalay qiyaastii 1 litir oo dhaqan ah xaalado isku mid ah, kaas oo markaa loo isticmaalay in lagu tallaalo qiyaastii 9 litir oo dhaqan ah oo lagu iftiimiyay ~200 μmolm-2 s-1 muddo 72 saacadood ah. Unugyada waxaa lagu soo saaray centrifugation heerkul ah 7132 RCF muddo 30 daqiiqo ah, dib ayaa loogu celiyey ~10 ml oo ah 20 mM tris-HCl (pH 8.0), waxaana lagu keydiyey -20°C ilaa loo baahdo.
Ka dib dhalaalinta, ku dar qaar ka mid ah kiristaalo deoxyribonuclease I (Merck, UK), lysozyme (Merck, UK) iyo laba kiniin oo Roche holoenzyme protease inhibitor (Merck, UK) unugyada dib loo hakiyey. Unug cadaadis Faransiis ah oo 20,000 psi ah (Aminco, USA), unugyada waxaa lagu carqaladeeyey 8 ilaa 12 jeer. Ka dib markii laga saaray unugyada aan jabnayn iyo qashinka aan milmi karin iyadoo la adeegsanayo centrifugation 18,500 RCF muddo 15 daqiiqo ah heerkul ah 4°C, xuubka waxaa laga soo saaray lysate-ka midabka leh iyadoo la isticmaalayo centrifugation 113,000 RCF muddo 2 saacadood ah heerkul ah 43,000°C. Iska tuur jajabka milmi kara oo dib ugu celi xuubka midabka leh 100 ilaa 200 ml oo ah 20 mM tris-HCl (pH 8.0) oo isku mid noqo ilaa aysan jirin isku-darka muuqda. Xuubka la laalay waxaa lagu dhex geliyay 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, USA) oo ka kooban 2% (w/v) β-DDM muddo 1 saac ah mugdiga 4°C iyadoo si tartiib ah loo walaaqayo. Kadib centrifuge-ka 70°C si uu u milmo 150,000 RCF heerkul ah 4°C muddo 1 saac ah si looga saaro haraaga aan milmin.
Xuubka milmaya ee ka imanaya nooca ΔpufW ayaa lagu mariyey tiir isdhaafsi ah oo 50 ml ah oo DEAE Sepharose ion ah oo leh saddex mug oo tiir ah (CV) oo ah kayd xidhmo [20 mM tris-HCl (pH 8.0) oo ka kooban 0.03% (w / v) β-DDM]. Ku dhaq tiirka laba kayd xidhmo oo CV ah, ka dibna ku dhaq tiirka laba kayd xidhmo oo ka kooban 50 mM NaCl. Isku-dhafka RC-LH116 waxaa lagu daboolay jaantus toosan oo ah 150 ilaa 300 mM NaCl (oo ku jira kayd xidhmo) oo ku yaal 1.75 CV, isku-dhafka isku-xidhka ee soo harayna waxaa lagu daboolay kayd xidhmo oo ka kooban 300 mM NaCl oo ku jira 0.5 CV. Soo ururi nuugista inta u dhaxaysa 250 iyo 1000 nm, jajabka ku hay saamiga nuugista (A880/A280) oo ka weyn 1 marka la gaaro 880 ilaa 280 nm, laba jeer ku milmi kaydka xidhitaanka, oo mar kale isticmaal isla habkaas tiirka DEAE On cleansing. Ku milmi jajabyada saamiga A880/A280 oo ka sarreeya 1.7 iyo A880/A805 oo ka sarreeya 3.0, samee wareegga saddexaad ee is-weydaarsiga ion-ka, oo hayso jajabyada saamiga A880/A280 oo ka sarreeya 2.2 iyo saamiga A880/A805 oo ka sarreeya 5.0. Isku-dhafka qayb ahaan la nadiifiyey ayaa lagu ururiyay ~2 ml oo ku jira shaandhada centrifugal-ka ee Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, UK), waxaana lagu shubay tiir Superdex 200 16/600 size discharge column (GE Healthcare, US) oo ka kooban 200 mM NaCl buffer, ka dibna lagu dhex tuuray isla kaydka 1.5 CV. Soo ururi spectra nuugista ee jajabka ka-saarista cabbirka, oo xoogga saar spectra nuugista iyadoo la adeegsanayo saamiga A880/A280 ee ka badan 2.4 iyo A880/A805 ee ka badan 5.8 ilaa 100 A880, isla markiiba u isticmaal diyaarinta shabagga cryo-TEM ama kaydinta Ku hay -80°C ilaa loo baahdo.
Xuubka milmaya ee ka imanaya PufW-His ayaa lagu mariyey tiir 20 ml ah oo HisPrep FF Ni-NTA Sepharose ah (20 mM tris-HCl (pH 8.0) oo ka kooban 200 mM NaCl iyo 0.03% (w/w)) oo ku jira kaydka IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM). Tiirka waxaa lagu dhaqay shan CV oo ah kaydka IMAC, ka dibna waxaa lagu mayray shan CV oo ah kaydka IMAC oo ka kooban 10 mM histidine. Isku-dhafka xudunta waxaa laga soo saaray tiirka iyadoo la adeegsanayo shan kayd IMAC oo ka kooban histidine 100 mM. Jajabku wuxuu ka kooban yahay isku-dhafka RC-LH114-W waxaa lagu ururiyay ~10 ml oo ku jira taangi la walaaqay oo lagu qalabeeyay shaandhada Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), oo lagu qasi jiray 20 jeer kaydka xidhitaanka, ka dibna lagu daray 25 ml Tiirka DEAE Sepharose, afar CV oo ku xiran kaydka ayaa hore loo isticmaalaa. Tiirka ku dhaq afar kayd oo CV ah, ka dibna ku dheji isku-dhafka siddeed CV oo leh jaantus toosan oo ah 0 ilaa 100 mM NaCl (oo ku jira kayd isku xiran), iyo afarta CV ee soo hartay oo ka kooban kayd isku xiran oo 100 mM ah. Isku-dhafka haray ee ku soo baxay sodium chloride oo lagu daray saamiga A880/A280 oo ka sarreeya 2.4 iyo saamiga A880/A805 oo ka sarreeya 4.6 jajab ayaa lagu ururiyay ~2 ml oo ku jira shaandhada centrifugal ee Amicon 100,000 MWCO, waxaana lagu buuxiyay 1.5 CV IMAC oo horay loo sii diyaariyay. Buffer wuxuu u dhigmaa Superdex 200 16/600 cabbirka ka-saarista, ka dibna wuxuu ku dhex milmay isla kayd isku mid ah oo ka sarreeya 1.5 CV. Soo ururi nuugista jajabyada ka-saarista cabbirka oo xoogga saar nuugista iyadoo la adeegsanayo saamiga A880/A280 ee ka sarreeya saamiga 2.1 iyo A880/A805 ee ka sarreeya 4.6 ilaa 100 A880, kuwaas oo isla markiiba loo isticmaalo diyaarinta shabagga TEM ee la qaboojiyey ama lagu kaydiyo -80°C ilaa inta loo baahdo.
Qaboojiye Leica EM GP ah ayaa loo isticmaalay in lagu diyaariyo shabagyada TEM ee heerkulka hooseeya. Isku-dhafka waxaa lagu qasi jiray IMAC buffer ilaa A880 oo ah 50, ka dibna 5μl waxaa lagu shubay shabag naxaas ah oo QUANTIFOIL 1.2/1.3 ah oo cusub oo lagu dahaadhay kaarboon (Agar Scientific, UK). Ku shid shabagga 20°C iyo qoyaan qaraabo ah 60% muddo 30 ilbiriqsi ah, ka dibna ku tirtir qalajin muddo 3 ilbiriqsi ah, ka dibna ku dami dareeraha ethane ee -176°C.
Xogta isku-dhafka RC-LH114-W waxaa lagu duubay eBIC (Xarunta Bayoolajiyada Elektarooniga ah) (Isha Iftiinka ee British Diamond) iyadoo la adeegsanayo mikroskoob Titan Krios, kaas oo ka shaqeeya danab xawaare sare u qaadaya 300kV, oo leh weyneyn magaceed oo ah 130,000× iyo tamar ah - Dooro farqiga 20 eV. Gatan 968 GIF Quantum oo leh qalabka ogaanshaha ugu sarreeya ee K2 ayaa loo isticmaalay in lagu duubo sawirrada qaabka tirinta si loo ururiyo xogta. Cabbirka pixel-ka ee la hagaajiyay waa 1.048Å, heerka qiyaastana waa 3.83 e-Å-2s-1. Waxaan filimka ku soo ururiyay 11 ilbiriqsi gudahood oo waxaan u qaybiyay 40 qaybood. Isticmaal aagga dahaarka leh ee kaarboonka si aad dib ugu soo celiso mikroskoobka, ka dibna u ururi saddex filim godkiiba. Wadarta guud, 3130 filim ayaa la ururiyay, iyadoo qiimaha defocus uu u dhexeeyay -1 iyo -3μm.
Xogta isku-dhafka RC-LH116 waxaa lagu soo ururiyay iyadoo la adeegsanayo isla mikroskoobka oo ku yaal Shaybaarka Qaab-dhismeedka Asterbury (Jaamacadda Leeds, UK). Xogta waxaa lagu soo ururiyay qaabka tirinta iyadoo la weyneynayo 130 k, cabbirka pixel-kana waxaa lagu hagaajiyay 1.065 Å iyadoo la isticmaalayo qiyaas ah 4.6 e-Å-2s-1. Filimka waxaa lagu duubay 12 ilbiriqsi waxaana loo qaybiyay 48 qaybood. Guud ahaan, 3359 filim ayaa la soo ururiyay, iyadoo qiimaha defocus uu u dhexeeyay -1 iyo -3μm.
Dhammaan habaynta xogta waxaa lagu sameeyaa dhuumaha Relion 3.0 (42). Adeegso Motioncorr 2 (43) si aad u saxdo dhaqdhaqaaqa iftiinka iyadoo la miisaamayo qiyaasta, ka dibna isticmaal CTFIND 4.1 (44) si aad u go'aamiso cabbirka CTF (shaqada wareejinta isbarbardhigga). Sawir-qaadayaasha caadiga ah ee ka dambeeya marxaladahan habaynta bilowga ah waxaa lagu muujiyay Jaantuska 2. S16. Qaabka xulashada otomaatiga ah waxaa lagu sameeyaa iyadoo gacanta lagu dooranayo qiyaastii 250 pixels oo ah 1000 walxood oo ku jira qaab-dhismeed 250-pixel ah iyo kala-soocid laba-cabbir ah oo aan lahayn tixraac laba-cabbir ah (2D), taasoo diidaysa kala-soociddaas oo buuxisa wasakhda muunadda ama aan lahayn astaamo la garan karo. Kadib, xulasho otomaatig ah ayaa lagu sameeyay dhammaan sawirrada yar yar, RC-LH114-W-na wuxuu ahaa 849,359 walxood, isku-dhafka RC-LH116-na wuxuu ahaa 476,547 walxood. Dhammaan walxaha la xushay waxay mareen laba wareeg oo kala-soocid 2D ah oo aan tixraac lahayn, ka dib socod kasta, walxaha buuxiya aagga kaarboonka, wasakhowga muunadda, astaamo muuqda ama walxaha si xooggan isu dulsaaran ayaa la diidayaa, taasoo keentay in 772,033 (90.9%) iyo 359,678 (75.5%) Walxaha waxaa loo isticmaalaa kala-soocidda 3D ee RC-LH114-W iyo RC-LH116 siday u kala horreeyaan. Qaabka tixraaca 3D ee bilowga ah waxaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo habka hoos u dhaca jihada stochastic. Iyadoo la adeegsanayo qaabka bilowga ah tixraac ahaan, walxaha la xushay waxaa loo kala saaray afar qaybood oo 3D ah. Adigoo isticmaalaya qaabka qaybtan tixraac ahaan, samee sifeynta 3D ee walxaha ku jira qaybta ugu weyn, ka dibna isticmaal shaandhada hoose ee bilowga ah ee 15Å si aad u daboosho aagga dareeraha, ku dar 6 pixels oo geeso jilicsan ah, ka dibna dib u habeyn ku samee pixels-ka si loo saxo shaqada wareejinta Modulation-ka ugu sarreysa ee Gatan K2 ee qalabka ogaanshaha sare. Xogta RC-LH114-W, qaabkan bilowga ah waxaa wax laga beddelay iyadoo laga saarayo cufnaanta xooggan ee cidhifyada maaskarada (laga jaray cufnaanta isku-dhafka asaasiga ah ee UCSF Chimera). Moodooyinka ka dhashay (xalalka RC-LH114-W iyo RC-LH116 waa 3.91 iyo 4.16 Å, siday u kala horreeyaan) waxaa loo isticmaalaa tixraac ahaan wareegga labaad ee kala-soocidda 3D. Walxaha la isticmaalay waxaa loo qaybiyaa fasalka 3D ee bilowga ah mana ku jiraan xiriir xooggan oo xaafadda ah. Is-dulsaar ama la'aanta sifooyinka qaab-dhismeedka ee muuqda. Ka dib wareegga labaad ee kala-soocidda 3D, qaybta leh xallinta ugu sarreysa ayaa la doortay [RC-LH114-W, hal qayb waa 377,703 walxood (44.5%), RC-LH116, waxaa jira laba qaybood, oo wadarta guud tahay 260,752 walxood (54.7%) , Halka ay isku mid yihiin oo keliya marka la isku waafajiyo ka dib wareegga bilowga ah oo leh farqi yar]. Walxaha la xushay waxaa dib loogu soo saaraa sanduuq 400-pixel ah waxaana lagu sifeeyaa sifeynta 3D. Maaskarada dareeraha ah waxaa lagu sameeyaa iyadoo la isticmaalayo shaandhada hoose ee bilowga ah ee 15Å, ballaarinta khariidadda 3 pixel iyo maaskaro jilicsan oo 3 pixel ah. Iyadoo la adeegsanayo sifeynta CTF ee walxaha-qaybta ah, sixitaanka dhaqdhaqaaqa walxaha-qaybta ah iyo wareegga labaad ee sifeynta CTF ee walxaha-qaybta ah, sifeynta 3D, maaskarada dareeraha ah iyo dib-u-habaynta ayaa la sameeyaa ka dib tallaabo kasta si loo sii hagaajiyo qaab-dhismeedka ka dhashay. Iyadoo la adeegsanayo qiimaha goynta FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) ee 0.143, xallinta moodooyinka ugu dambeeya ee RC-LH114-W iyo RC-LH116 waa 2.65 iyo 2.80Å, siday u kala horreeyaan. Qalooca FSC ee qaabka ugu dambeeya waxaa lagu muujiyay Jaantuska 2. S17.
Dhammaan taxanaha borotiinka waxaa laga soo dejiyay UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) waxaa loo isticmaalay in lagu dhiso qaab isku mid ah oo RC ah, kaas oo ka kooban taxanaha borotiinka ee RC-L, RC-M iyo RC-H iyo qaab-dhismeedka kiristaalka ee Rba. sphaeroides RC waxaa loo isticmaalay qaab ahaan (PDB ID: 5LSE) (46). Adeegso qalabka "khariidadda ku habboon" ee UCSF Chimera si aad ugu habboonaato qaabka la soo saaray khariidadda (47), u hagaajiso qaab-dhismeedka borotiinka, iyo cofactor [4×BChl a (magaca haraaga maktabadda monomer = BCL), 2×BPh a (BPH), hal ama laba nooc oo UQ10 ah (U10), hal bir aan heme ahayn (Fe) iyo hal 3,4-dihydrohexacarbonylcholine (QAK)] isticmaal Coot (48) si aad ugu darto. Maadaama QAK aan laga heli karin maktabadda monomer, waxaa lagu sameeyay parameter iyadoo la adeegsanayo qalabka eLBOW ee PHENIX (49).
Marka xigta, cutubka LH1 ayaa la dhisay. Markii hore, qalabka dhismaha otomaatiga ah ee PHENIX (49) ayaa loo isticmaalay in si toos ah loogu dhiso qayb ka mid ah taxanaha LH1 iyadoo la adeegsanayo khariidadda iyo taxanaha borotiinka LH1-α iyo LH1-β sida gelinta. Dooro cutubka LH1 ee ugu dhammaystiran, ka soo saar oo ku shub Coot, gacanta ku dar taxanaha maqan ee ku jira, oo gacanta ku nadiifi qaab-dhismeedka oo dhan ka hor inta aan lagu darin laba BCls a (BCL) iyo spirilloxanthin (CRT) [sida waafaqsan cufnaanta Rps ee isku-dhafka LH1 iyo waxa ku jira carotenoid-ka la yaqaan. Noocyada (17)]. Nuqul cutubka LH1 ee dhammaystiran, oo isticmaal "Qalabka Khariidadda Docking" ee UCSF Chimera si aad ugu xirto aagga aan moodeelka ahayn ee ku xiga ee cufnaanta LH1, ka dibna ku sifeyso Coot; ku celi habka ilaa dhammaan cutubyada LH1 la qaabeeyo. Qaab-dhismeedka RC-LH114-W, iyadoo laga soo saarayo cufnaanta aan la qoondayn ee Coot, borotiinka waxaa laga soocay qaybaha aan borotiinka ahayn ee haray ee khariidadda USCF Chimera, qalabka Autobuild-kana waxaa loo isticmaalaa in lagu dhiso qaabka bilowga ah, iyo qaab-dhismeedka qaybaha hoose ee haray (protein-W). PHENIX (49). Ku dar taxane kasta oo maqan qaabka ka dhasha Coot (48), ka dibna gacanta ku nadiifi qaybta hoose oo dhan. Cufnaanta aan la qoondayn ee hartay waxay ku habboon tahay isku-darka dufanka (ID-ga maktabadda monomer-ka ee CDL = CDL, POPC = 6PL iyo POPG = PGT), saabuunta β-DDM (LMT) iyo molecules-ka UQ10 (U10). Isticmaal hagaajinta PHENIX (49) iyo hagaajinta gacanta ee Coot (48) si aad u dhammaystirto qaabka bilowga ah ee dhammaystiran ilaa tirakoobka qaabka iyo tayada muuqaalka ee ku habboonaanta aan si dheeraad ah loo horumarin karin. Ugu dambeyntii, isticmaal LocScale (50) si aad u afaysto khariidadda maxalliga ah, ka dibna samee dhowr wareeg oo kale oo ah qaabaynta cufnaanta aan la qoondayn iyo hagaajinta otomaatiga ah iyo gacanta.
Peptides-ka, cofactors-ka iyo dufanka kale iyo quinone-yada ku xiran cufnaantooda waxaa lagu muujiyay Jaantusyada 1 iyo 2. S18 ilaa S23. Macluumaadka tirakoobka ee qaabka ugu dambeeya waxaa lagu muujiyay Shaxda S1.
Haddii aan si kale loo cayimin, spectra-ka nuugista UV/Vis/NIR waxaa lagu soo ururiyay spectrophotometer-ka Cary60 (Agilent, USA) 1 nm muddo u dhaxaysa 250 nm ilaa 1000 nm iyo waqti isku-dhafan oo ah 0.1s.
Muunadda ku milmi cuvette quartz ah oo leh waddo 2 mm ah oo loo maro A880 oo ah 1, oo soo ururi spectrum-ka nuugista inta u dhaxaysa 400 iyo 1000 nm. Spectra-ga wareegga ah ee dichroic waxaa lagu soo ururiyay spectropolarimeter-ka Jasco 810 (Jasco, Japan) 1 nm oo u dhexeeya 400 nm iyo 950 nm oo ah heerka sawirka 20 nm min-1.
Isugeynta dabar-goynta molar-ka waxaa lagu go'aamiyaa iyadoo lagu qaso isku-dhafka asaasiga ah A880 oo qiyaastii ah 50. Ku mil mugga 10μl ee ku jira kaydka isku xidhka 990μl ama methanol, oo isla markiiba soo ururi nuugista si loo yareeyo burburka BChl. Waxyaabaha BChl ee muunad kasta oo methanol ah waxaa lagu xisaabiyay isku-dhafka dabar-goynta 771 nm oo ah 54.8 mM-1 cm-1, waxaana la go'aamiyay isku-dhafka dabar-goynta (51). U qaybi isku-darka BChl ee la cabbiray 32 (RC-LH114-W) ama 36 (RC-LH116) si loo go'aamiyo isku-darka asaasiga ah, kaas oo markaa loo isticmaalo in lagu go'aamiyo isku-dhafka nuugista ee muunad isku mid ah oo lagu soo ururiyey isku-darka dabar-goynta kaydka. barbar socda. Saddex cabbir oo soo noqnoqda ayaa loo qaaday muunad kasta, celceliska nuugista ugu badan ee BChl Qy ayaa loo isticmaalay xisaabinta. Isugeynta dabargoynta ee RC-LH114-W oo lagu cabiray 878 nm waa 3280±140 mM-1 cm-1, halka isku-darka dabargoynta ee RC-LH116 oo lagu cabiray 880 nm uu yahay 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 waxaa lagu qiyaasay habka ku jira (52). Marka la soo koobo, marxaladda dambe ee HPLC (RP-HPLC) waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo nidaamka Agilent 1200 HPLC. Ku milmi qiyaastii 0.02 nmol oo ah RC-LH116 ama RC-LH114-W 50μl oo ah 50:50 methanol:chloroform oo ka kooban 0.02% (w/v) ferric chloride, oo ku dur Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4.6 mm oo horay loo sii dheellitiray. Ku milmi 1 ml-1 daqiiqo-1 heerkul ah 40°C oo ah dareeraha HPLC (80:20 methanol:2-propanol) oo ku yaal tiir ×25 cm ah. Samee qulqulka isocratic ee dareeraha HPLC si aad ula socoto nuugista 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) iyo 780 nm (BChl) muddo 1 saac ah. Ugu sarreeya ee koromatogram-ka 275 nm 25.5 daqiiqo ayaa la isku daray, kaas oo aan ku jirin iskudhisyo kale oo la ogaan karo. Aagga isku dhafan waxaa loo isticmaalaa in lagu xisaabiyo xaddiga molar ee UQ10 ee laga soo saaray iyadoo la tixraacayo qalooca cabbiraadda ee laga xisaabiyay duritaanka heerarka saafiga ah laga bilaabo 0 ilaa 5.8 nmol (Jaantuska S14). Muunad kasta waxaa lagu falanqeeyay saddex nuqul, qaladka la soo sheegayna wuxuu u dhigmaa SD-ga celceliska.
Xal ka kooban isku-dhafka RC-LH1 oo leh nuugista ugu badan ee Qy oo ah 0.1 ayaa la diyaariyey iyadoo la adeegsanayo cytochrome wadnaha fardaha oo la dhimay 30 μM (Merck, UK) iyo 0 ilaa 50 μMUQ2 (Merck, UK). Saddex muunado oo 1-ml ah ayaa la diyaariyey iyadoo la adeegsanayo isku-darka UQ2 kasta waxaana lagu kululeeyay habeenkii mugdiga 4°C si loo hubiyo in si buuxda loola qabsado mugdiga ka hor inta aan la cabbirin. Xalka waxaa lagu shubay spectrophotometer modular OLIS RSM1000 oo ku qalabaysan shabag olol 300 nm ah/500 line shabag, 1.24 mm gudaha, 0.12 mm dhexda iyo 0.6 mm godad. Shaandho dhererkeedu yahay 600 nm ayaa la dhigayaa albaabka tuubada sawirka muunadda iyo tuubada sawir-qaadista tixraaca si looga saaro iftiinka kicinta. Neefsashada waxaa la kormeeray 550 nm iyadoo la adeegsanayo waqtiga isku-dhafka oo ah 0.15 ilbiriqsi. Iftiinka kicinta waxaa laga soo saaraa LED-ka 880 nm M880F2 (Diode-ka Iftiinka Soo Saara) (Thorlabs Ltd., UK) iyada oo loo marayo fiilada fiber optic-ga oo leh 90% xoog iyada oo loo marayo kontoroolka DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) waxaana loo sii daayaa isha iftiinka xagal 90° ah. Birta cabbiraadda ayaa ka soo horjeedda muraayadda si ay u soo celiso iftiin kasta oo aan markii hore nuugin muunaddu. La soco nuugista 10 ilbiriqsi ka hor inta uusan ifku gaarin 50 ilbiriqsi. Kadib nuugista ayaa si dheeraad ah loola socday 60 ilbiriqsi mugdiga si loo qiimeeyo heerka uu quinolol si iskiis ah u yareeyo cytochrome c23 + (fiiri Jaantuska S8 si aad u hesho xog cayriin ah).
Xogta waxaa lagu farsameeyay iyadoo lagu rakibayo heer bilow ah oo toosan 0.5 ilaa 10 ilbiriqsi gudahood (iyadoo ku xiran fiirsashada UQ2) iyo celcelis ahaan heerarka dhammaan saddexda muunad ee fiirsashada UQ2 kasta. Fiirsashada RC-LH1 ee lagu xisaabiyay isku-darka baabi'inta ayaa loo isticmaalay in lagu beddelo heerka hufnaanta katalytic-ga, oo lagu sawiray Origin Pro 2019 (OriginLab, USA), waxaana lagu rakibay qaabka Michaelis-Menten si loo go'aamiyo qiimayaasha Km iyo Kcat ee muuqda.
Cabbiraadaha nuugista ku-meel-gaarka ah, muunadda RC-LH1 waxaa lagu qasi jiray ~2μM oo ku jirta kaydka IMAC oo ka kooban 50 mM sodium ascorbate (Merck, USA) iyo 0.4 mM Terbutin (Merck, USA). Ascorbic acid waxaa loo isticmaalaa sidii deeq-bixiye elektaroonik ah oo allabaryo ah, tert-butaclofen-na waxaa loo isticmaalaa sidii joojiye QB ah si loo hubiyo in deeq-bixiyaha RC-ga ugu weyn uu sii yaraado (taas oo ah, aan la sawirin) inta lagu jiro habka cabbirka. Qiyaastii 3 ml oo muunad ah ayaa lagu daraa unug wareeg ah oo gaar ah (qiyaastii 0.1 m dhexroor, 350 RPM) oo leh dherer waddo indhaha ah oo 2 mm ah si loo hubiyo in muunadda ku jirta waddada laysarka ay leedahay waqti ku filan oo loogu talagalay la qabsiga mugdiga ah ee u dhexeeya garaaca kicinta. Isticmaal garaaca laser-ka ~100-fs si aad u xoojiso nidaamka laysarka Ti: Sapphire (Spectra Physics, USA) si aad u kiciso muunadda 880 nm heer ku celcelin ah oo ah 1 kHz (20 nJ NIR ama 100 nJ Vis). Kahor intaadan ururin xogta, muunadda u bandhig iftiinka kicinta ilaa 30 daqiiqo. Soo-gaadhistu waxay sababi doontaa in QA la joojiyo (laga yaabee inay yareyso QA hal mar ama laba jeer). Laakiin fadlan ogow in habkani uu noqon karo mid la beddeli karo sababtoo ah ka dib muddo dheer oo la qabsiga mugdiga ah, RC si tartiib tartiib ah ayuu ugu soo laaban doonaa dhaqdhaqaaqa QA. Qalabka cabbira heerkulka ee Helios (Ultrafast Systems, USA) ayaa loo isticmaalay in lagu cabbiro muuqaalka ku-meel-gaarka ah oo leh waqti dib u dhac ah oo ah -10 ilaa 7000 ps. Isticmaal barnaamijka Surface Xplorer (Ultrafast Systems, USA) si aad u kala saarto xogta, ka dibna isku dar oo u habayso. Isticmaal xirmada software-ka CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) si aad u isticmaasho xogta isku dhafan si aad u hesho muuqaal kala duwan oo la xiriira burburka, ama isticmaal shaqo ka kooban jaantusyo badan oo leh jawaabta qalabka si ay ugu habboonaato horumarka hal-hirarka ee muuqaalka ee Origin (OriginLab, USA).
Sida kor ku xusan (53), filim sawir-sameyn ah oo ka kooban isku-dhafka LH1 oo aan lahayn anteenada RC iyo LH2 ee durugsan ayaa la diyaariyey. Xuubka waxaa lagu qasi jiray 20 mM tris (pH 8.0) ka dibna waxaa lagu shubay quartz cuvette oo leh waddo indhaha ah oo 2 mm ah. Garaaca laysarka 30nJ ayaa loo isticmaalay in lagu kiciyo muunadda 540 nm iyadoo dib u dhac uu yahay -10 ilaa 7000 ps. U habeey xogta sida lagu sharaxay muunadda Rps. pal.
Xuubka waxaa lagu xoqay centrifugation 150,000 RCF muddo 2 saacadood ah heerkul ah 4°C, ka dibna nuugistiisa 880 nm ayaa dib loogu celiyey 20 mM tris-HCl (pH 8.0) iyo 200 mM NaCl. Kala diri xuubka adigoo si tartiib ah ugu walaaqaya 2% (w/v) β-DDM muddo 1 saac ah mugdiga 4°C. Muunadda waxaa lagu qasi jiray 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ilaa ay ka gaarto isku-darka borotiinka 2.5 mg ml-1 (falanqaynta Bio-Rad). Habayn dheeraad ah ayaa laga sameeyay habkii hore loo daabacay (54), iyadoo laga bilaabayo qasidda borotiinka 50 μg wadarta guud ee 50 μl TEAB oo ka kooban 1% (w/v) sodium laurate (Merck, UK). Ka dib sonication muddo 60 ilbiriqsi ah, waxaa lagu yareeyay 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) heerkul ah 37°C muddo 30 daqiiqo ah. S-alkylation, muunadda ku shub 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) oo ku dar xal kayd ah oo isopropanol ah oo 200 mM ah muddo 10 daqiiqo ah heerkulka qolka. Dheefshiidka Proteolytic waxaa lagu sameeyay iyadoo lagu daray 2 μg trypsin/endoproteinase Lys-C isku darka (Promega UK) waxaana lagu kululeeyay 37°C muddo 3 saacadood ah. Surfactant-ka laurate waxaa laga soo saaray iyadoo lagu daray 50 μl ethyl acetate iyo 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) oo lagu shubay 60 ilbiriqsi. Kala-soocidda wejiga waxaa lagu dhiirrigeliyay centrifugation 15,700 RCF muddo 5 daqiiqo ah. Sida ku cad hab-maamuuska soo saaraha, tiir wareeg ah oo C18 ah (Thermo Fisher Scientific, UK) ayaa loo isticmaalay in si taxaddar leh loo neefsado oo looga saaro milixda wejiga hoose ee ka kooban peptide-ka. Ka dib markii lagu qalajiyo centrifugation faakiyuum ah, muunadda waxaa lagu milmay 0.5% TFA iyo 3% acetonitrile, 500 ng-na waxaa lagu falanqeeyay chromatography nanoflow RP oo ay weheliso spectrometry cuf iyadoo la adeegsanayo xuduudaha nidaamka ee hore loo faahfaahiyay.
Adeegso MaxQuant v.1.5.3.30 (56) si aad u hesho aqoonsiga borotiinka iyo tirada si aad u raadiso xogta Rps. palustris proteome (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Xogta proteomics-ka cufnaanta ayaa lagu shubay Isbahaysiga ProteomeXchange iyada oo loo marayo kaydka lammaanaha PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) iyada oo loo marayo aqoonsiga xogta PXD020402.
Falanqaynta RPLC oo ay weheliso electrospray mass ionization spectrometry, isku-dhafka RC-LH1 waxaa laga diyaariyey Rps-ka duurjoogta ah. Iyada oo la adeegsanayo habka hore loo daabacay (16), uruurinta borotiinka ee unugyada palustris waxay ahayd 2 mg ml-1 oo ku jira 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl iyo 0.03% (w/v) β- (Bio-Rad analysis)) DDM. Sida ku xusan hab-raaca soo saaraha, isticmaal qalabka nadiifinta 2D (GE Healthcare, USA) si aad u soo saarto 10 μg borotiin iyadoo loo marayo habka roobka, oo aad ku milmiso daadinta biyaha 20 μl 60% (v/v) formic acid (FA), 20% (v/v) Acetonitrile iyo 20% (v/v) biyo. Shan microliters waxaa falanqeeyay RPLC (Dionex RSLC) oo ay weheliso mass spectrometry (Maxis UHR-TOF, Bruker). Isticmaal tiirka MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) si aad u kala saarto 60°C iyo 100μlmin -1, oo leh kala-soocid 85% (v / v) dareeraha A [0.1% (v / v) FA iyo 0.02% (V/v) xalka biyaha TFA] ilaa 85% (v/v) dareeraha B [0.1% (v/v) FA iyo 0.02% (v/v) ee 90% (v/v) acetonitrile TFA] Iyada oo la adeegsanayo isha ionization-ka elektiroonigga caadiga ah iyo xuduudaha caadiga ah in ka badan 60 daqiiqo, spectrometer-ka cufnaanta wuxuu helaa 100 ilaa 2750 m/z (saamiga cufka-ilaa-kharashka). Iyada oo la kaashanayo bogga kheyraadka ExPASy bioinformatics qalabka FindPept (https://web.expasy.org/findpept/), sawir spectrometer-ka cufnaanta ilaa qaybaha hoose ee isku-dhafka.
Unugyada waxaa la koray 72 saacadood iyadoo la isticmaalayo 100 ml oo NF-hoose ah (10μMm-2 s-1), dhexdhexaad ah (30μMm-2 s-1) ama sare (300μMm-2 s-1). Dhexdhexaad ah M22 (dhexdhexaad ah M22 kaas oo laga saaray ammonium sulfate iyo sodium succinate lagu beddelay sodium acetate) dhalo 100 ml ah oo lagu buufiyo (23). Shan wareeg oo 30-s ah, kuul galaas ah oo 0.1 micron ah ayaa lagu shubay saamiga mugga 1:1 si loo nadiifiyo unugyada oo loogu qaboojiyo barafka muddo 5 daqiiqo ah. Waxyaabaha aan milmin, unugyada aan jabnayn iyo kuul galaas ah waxaa lagu saaray centrifugation 16,000 RCF muddo 10 daqiiqo ah oo lagu shubay microcentrifuge benchtop ah. Xuubka waxaa lagu kala saaray rotor Ti 70.1 ah oo leh 100,000 RCF oo ku jira 20 mM tris-HCl (pH 8.0) oo leh 40/15% (w/w) sucrose gradient muddo 10 saacadood ah.
Sida lagu sharraxay shaqadeennii hore, ogaanshaha difaaca jirka ee calaamadda His ee PufW (16). Marka la soo koobo, isku-dhafka asaasiga ah ee la nadiifiyey (11.8 nM) ama xuubka ka kooban isku-darka RC (iyadoo lagu go'aaminayo oksaydheynta oo laga jarayo kala duwanaanshaha la dhimay iyo isku-darka culayska ku yaal jelka wasakhaysan) ee ku jira 2x SDS loading buffer (Merck, UK) ayaa laba jeer la qasi jiray. Borotiinnada waxaa lagu kala saaray jel NuPage oo nuqul ah oo 12% ah (Thermo Fisher Scientific, UK). Jel waxaa lagu rinjiyeeyay Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) si loo raro loona arko qaybta hoose ee RC-L. Borotiinka ku jira jelka labaad waxaa loo wareejiyay xuubka polyvinylidene fluoride (PVDF) ee methanol-ka firfircoon (Thermo Fisher Scientific, UK) si loogu sameeyo baaritaan difaac. Xuubka PVDF waxaa lagu xannibay budada caanaha ee 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 iyo 5% (w / v) Tween-20 iyo 5% (w / v) oo laga saaray caanaha, ka dibna lagu dhex geliyay antibody-ga aasaasiga ah ee anti-His (oo lagu qasi karo batter-ka antibody-ga [50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl iyo 0.05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethel Laboratories, USA) muddo 4 saacadood ah. Ka dib markii lagu dhaqay 3 jeer muddo 5 daqiiqo ah qalabka difaaca jirka, xuubka waxaa lagu daray antibody-ga ka hortagga jiirka ee horseradish peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) (oo lagu qasi jiray 1:10,000 oo ku jira qalabka difaaca jirka). Ku dar si loo ogaado (5 daqiiqo ka dib 3 jeer lagu dhaqo qalabka difaaca jirka) adoo isticmaalaya substrate-ka kiimikada ee WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Italy) iyo Amersham Imager 600 (GE Healthcare, UK).
Adigoo sawiraya qaybinta xoogga ee jel kasta oo wasakhaysan ama marin immunoassay ah, isku-darka aagga ka hooseeya meesha ugu sarreysa iyo xisaabinta saamiga xoogga ee RC-L (jel wasakhaysan) iyo Protein-W (immunoassay), ee ImageJ (57) Hagaaji sawirka. Saamiyadan waxaa loo beddelay saamiga molar iyadoo la qiyaasayo in saamiga RC-L ilaa borotiinka-W ee muunadda saafiga ah ee RC-LH114-W uu ahaa 1:1 iyo in si caadi ah loo habeeyo xogta oo dhan si waafaqsan.
Wixii agab dheeraad ah ee maqaalkan, fadlan eeg http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Kani waa maqaal furan oo loo qaybiyay shuruudaha Ruqsadda Creative Commons Attribution License. Maqaalku wuxuu ogolaanayaa isticmaalka aan xadidnayn, qaybinta, iyo taranka ee warbaahin kasta iyadoo shuruud looga dhigayo in shaqada asalka ah si sax ah loo soo xigto.
Fiiro gaar ah: Waxaan kaa codsaneynaa oo keliya inaad bixiso cinwaankaaga emaylka si qofka aad bogga kula taliso uu u ogaado inaad rabto inuu arko emaylka iyo in uusan ahayn spam. Ma qaban doonno wax cinwaanada emaylka ah.
Su'aashan waxaa loo isticmaalaa in lagu tijaabiyo inaad tahay booqde iyo in laga hortago gudbinta spam-ka ee otomaatiga ah.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Qaab-dhismeedka xallinta sare leh ee isku-dhafka dabinka iftiinka 1 ee xarunta falcelinta waxay bixisaa aragtiyo cusub oo ku saabsan dhaqdhaqaaqa quinone.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe, Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirmaier, Andrew Hitchcock, C. Neil Hunter
Qaab-dhismeedka xallinta sare leh ee isku-dhafka dabinka iftiinka 1 ee xarunta falcelinta waxay bixisaa aragtiyo cusub oo ku saabsan dhaqdhaqaaqa quinone.
©2021 Ururka Maraykanka ee Horumarinta Sayniska. xuquuqda oo dhan way xifdisan yihiin. AAAS waa lammaane HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef iyo COUNTER. Horumarka Sayniska ISSN 2375-2548.