Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com. Nooca biraawsarka aad isticmaaleyso wuxuu leeyahay taageero CSS oo xaddidan. Natiijooyinka ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho nooc cusub oo biraawsarkaaga ah (ama aad joojiso Habka La-qabsiga ee Internet Explorer). Dhanka kale, si loo hubiyo taageerada socota, waxaan soo bandhigaynaa goobta iyada oo aan la isticmaalin qaabeyn ama JavaScript.
Asiidhka Propionic (PPA) waxaa loo isticmaalaa in lagu barto doorka cilladda mitochondrial ee xanuunnada horumarinta neerfaha sida xanuunka autism spectrum. PPA waxaa loo yaqaanaa inay carqaladeyso bayogenesis-ka mitochondrial, dheef-shiid kiimikaadka, iyo isbeddelka. Si kastaba ha ahaatee, saameynta PPA ee dhaqdhaqaaqa mitochondrial, kala-goynta iyo isku-dhafka ayaa weli dhibaato ku ah sababtoo ah dabeecadda isku-dhafan ee ku-meel-gaarka ah ee hababkan. Halkan, waxaan isticmaalnaa farsamooyin sawir-qaadis oo dhammaystiran si aan u baarno sida PPA u saamayso qaab-dhismeedka mitochondrial, qaab-dhismeedka, iyo dhaqdhaqaaqa unugyada SH-SY5Y ee u eg neerfaha. PPA (5 mM) waxay sababtay hoos u dhac weyn oo ku yimid aagga mitochondrial (p < 0.01), dhexroorka Feret iyo wareegga (p < 0.05), iyo aagga 2 (p < 0.01). Falanqaynta goobta dhacdooyinka Mitochondrial waxay muujisay koror weyn (p < 0.05) dhacdooyinka kala-goynta iyo isku-dhafka, taasoo ilaalinaysa sharafta shabakadda mitochondrial ee xaaladaha walaaca. Intaa waxaa dheer, muujinta mRNA ee cMYC (p < 0.0001), NRF1 (p < 0.01), TFAM (p < 0.05), STOML2 (p < 0.0001) iyo OPA1 (p < 0.05) ayaa si weyn hoos loogu dhigay. 01). Tani waxay muujinaysaa dib-u-habaynta qaab-dhismeedka mitochondrial, bayogenesis iyo dhaqdhaqaaqa si loo ilaaliyo shaqada xaaladaha walaaca. Xogtayadu waxay bixisaa aragti cusub oo ku saabsan saamaynta PPA ee dhaqdhaqaaqa mitochondrial waxayna iftiiminaysaa faa'iidada farsamooyinka sawir-qaadista ee barashada hababka sharciyeynta ee adag ee ku lug leh jawaabaha cadaadiska mitochondrial.
Mitochondria waa ka qaybgalayaasha muhiimka ah ee hawlaha unugyada kala duwan oo ka baxsan doorarkooda caadiga ah ee wax soo saarka tamarta iyo bayosynthesis. Dheef-shiid kiimikaadka Mitochondria waa nidaamiye muhiim ah oo ka shaqeeya calaamadaynta kaalshiyamka, dheef-shiid kiimikaadka iyo redox homeostasis, calaamadaynta bararka, isbeddelada epigenetic, faafitaanka unugyada, kala duwanaanshaha iyo dhimashada unugyada ee la barnaamijiyay1. Gaar ahaan, dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial waa mid muhiim u ah horumarka neerfaha, badbaadada iyo shaqada waxaana si weyn loogu lug leeyahay muuqaallo kala duwan oo ku saabsan neerfaha 2,3,4.
Tobankii sano ee la soo dhaafay, xaaladda dheef-shiid kiimikaadka ayaa soo baxday iyadoo ah nidaamiye dhexe oo neerfaha ku shaqeeya, kala-soocidda, bislaanshaha iyo balaastikada5,6. Dhawaan, qaab-dhismeedka mitochondrial iyo dhaqdhaqaaqa ayaa noqday qaybo muhiim ah oo ka mid ah mitosis, oo ah geeddi-socod firfircoon oo ilaaliya tiro badan oo mitochondria caafimaad qaba oo ku jira unugyada. Dhaqdhaqaaqa mitochondrial waxaa nidaamiya waddooyin isku-dhafan oo isku-dhafan oo u dhexeeya biogenesis mitochondrial iyo bioenergetics ilaa fission mitochondrial, isku-darka, gaadiidka iyo nadiifinta7,8. Joojinta mid ka mid ah hababkan isku-dhafan waxay wiiqaysaa dayactirka shabakadaha mitochondrial ee caafimaadka qaba waxayna leedahay cawaaqib xumo shaqo oo qoto dheer oo ku saabsan horumarinta neerfaha9,10. Runtii, khalkhalka dhaqdhaqaaqa mitochondrial waxaa lagu arkay cuduro badan oo dhimirka ah, neerfaha iyo horumarka neerfaha, oo ay ku jiraan xanuunnada autism spectrum (ASD)11,12.
ASD waa cudur neerfaha ku dhaca oo kala duwan oo leh qaab-dhismeed hidde-side iyo epigenetic oo adag. Dhaxalka ASD lama muran gelin karo, laakiin asalka molecular-ka ee hoose weli si liidata ayaa loo fahmay. Ururinta xogta laga helo moodooyinka hore ee kiliinikada, daraasadaha kiliinikada, iyo xogta molecular-ka ee multi-omics waxay bixiyaan caddayn sii kordheysa oo ah cillad mitochondrial ee ASD13,14. Waxaan horey u sameynay baaritaanka methylation DNA-ga genome-ballaaran koox bukaanno ah oo qaba ASD waxaana aqoonsannay hiddo-sideyaal methylated ah oo kala duwan oo ku urursan waddooyinka dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial15. Kadib waxaan soo sheegnay methylation kala duwan ee nidaamiyeyaasha dhexe ee bayogenesis-ka mitochondrial iyo dynamics, kaas oo lala xiriiriyay kororka tirada nuqulka mtDNA iyo muuqaalka dheef-shiid kiimikaadka kaadida ee isbeddelay ee ASD16. Xogtayadu waxay bixisaa caddayn sii kordheysa oo ah in dhaqdhaqaaqa mitochondrial iyo homeostasis ay door muhiim ah ka ciyaaraan pathophysiology-ga ASD. Sidaa darteed, hagaajinta fahamka farsamada ee xiriirka ka dhexeeya dhaqdhaqaaqa mitochondrial, qaab-dhismeedka, iyo shaqada waa yool muhiim ah oo cilmi-baaris socda oo lagu sameeyo cudurrada neerfaha ee lagu garto cillad mitochondrial labaad.
Farsamooyinka molecular-ka waxaa badanaa loo isticmaalaa in lagu barto doorka hiddo-sidayaasha gaarka ah ee jawaabaha cadaadiska mitochondrial. Si kastaba ha ahaatee, habkan waxaa xaddidi kara dabeecadda dhinacyo badan iyo kuwa ku meel gaarka ah ee hababka xakamaynta mitotic. Intaa waxaa dheer, muujinta kala duwan ee hiddo-sidayaasha mitochondrial waa tilmaame aan toos ahayn oo isbeddellada shaqada ah, gaar ahaan maadaama tiro kooban oo hiddo-sidayaasha ah si caadi ah loo falanqeeyo. Sidaa darteed, habab toos ah oo badan oo loogu talagalay barashada shaqada mitochondrial iyo tamarta bayoolojiga ayaa la soo jeediyay17. Qaab-dhismeedka Mitochondrial wuxuu si dhow ula xiriiraa dhaqdhaqaaqa mitochondrial. Qaabka Mitochondrial, isku xirnaanta, iyo qaab-dhismeedka ayaa muhiim u ah soo saarista tamarta iyo badbaadada mitochondrial iyo unugyada5,18. Intaa waxaa dheer, qaybaha kala duwan ee mitosis waxay diiradda saaraan isbeddellada qaab-dhismeedka mitochondrial, kuwaas oo u adeegi kara inay noqdaan qodobbo waxtar leh oo ku saabsan cilladda mitochondrial waxayna bixiyaan saldhig loogu talagalay daraasadaha farsamada ee xiga.
Qaab-dhismeedka Mitochondrial waxaa si toos ah loogu arki karaa iyadoo la adeegsanayo mikroskoobka elektaroonigga gudbinta (TEM), taasoo u oggolaanaysa daraasad faahfaahsan oo ku saabsan qaab-dhismeedka unugyada. TEM si toos ah ayay u sawirtaa qaab-dhismeedka, qaabka iyo qaab-dhismeedka mitochondrial cristae marka la xallinayo mitochondria shaqsiyeed, halkii ay ku tiirsanaan lahayd oo keliya qoraalka hidda-wadaha, muujinta borotiinka ama xuduudaha shaqada mitochondrial ee dadka unugyada17,19,20. Intaa waxaa dheer, TEM waxay fududeysaa daraasadda isdhexgalka ka dhexeeya mitochondria iyo organelles kale, sida endoplasmic reticulum iyo autophagosomes, kuwaas oo door muhiim ah ka ciyaara shaqada mitochondrial iyo homeostasis21,22. Sidaa darteed, tani waxay ka dhigaysaa TEM meel wanaagsan oo laga bilaabo barashada cilladda mitochondrial ka hor inta aan la diiradda saarin waddooyinka gaarka ah ama hiddo-wadaha. Maadaama shaqada mitochondrial ay si isa soo taraysa ugu habboon tahay neerfaha, waxaa jira baahi cad oo loo qabo in si toos ah iyo tiro ahaanba loo barto qaab-dhismeedka mitochondrial iyo dhaqdhaqaaqa moodooyinka neerfaha ee in vitro.
Maqaalkan, waxaan ku baareynaa dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee qaabka neerfaha ee cilladda mitochondrial ee xanuunka autism spectrum. Waxaan horey u soo sheegnay methylation kala duwan ee propionyl-CoA carboxylase beta (PCCB) ee ASD15, oo ah qayb ka mid ah enzyme-ka carboxylase ee mitochondrial PCC. Kala-goynta PCC waxaa loo yaqaanaa inay keento ururin sun ah oo ah waxyaabaha ka soo baxa propionyl, oo ay ku jiraan propionic acid (PPA)23,24,25. PPA waxaa la muujiyay inay carqaladeyso dheef-shiid kiimikaadka neerfaha iyo inay beddesho dhaqanka gudaha jirka waana qaab xayawaan ah oo la aasaasay oo lagu baranayo hababka horumarinta neerfaha ee ku lug leh ASD26,27,28. Intaa waxaa dheer, PPA waxaa la soo sheegay inay carqaladeyso kartida xuubka mitochondrial, bayogenesis iyo neefsashada gudaha jirka waxaana si weyn loogu isticmaalay in lagu daydo cilladda mitochondrial ee neurons29,30. Si kastaba ha ahaatee, saameynta cilladda mitochondrial ee PPA ay keento ee qaab-dhismeedka mitochondrial iyo dhaqdhaqaaqa weli si liidata ayaa loo fahmay.
Daraasaddani waxay isticmaashaa farsamooyin sawir-qaadis oo dhammaystiran si loo cabbiro saamaynta PPA ee qaab-dhismeedka mitochondrial, firfircoonida, iyo shaqada unugyada SH-SY5Y. Marka hore, waxaan soo saarnay hab TEM ah si loo arko isbeddellada qaab-dhismeedka mitochondrial iyo ultrastructure17,31,32. Marka la eego dabeecadda firfircoonida ee mitochondria33, waxaan sidoo kale isticmaalnay falanqaynta goobta dhacdooyinka mitochondrial (MEL) si loo cabbiro isbeddellada dheelitirka u dhexeeya dhacdooyinka kala-goysyada iyo isku-dhafka, tirada mitochondrial iyo mugga hoos yimaada cadaadiska PPA. Ugu dambeyntii, waxaan baarnay in qaab-dhismeedka mitochondrial iyo firfircoonida ay la xiriiraan isbeddellada muujinta hidda-wadaha ku lug leh bayogenesis, kala-goysyada, iyo isku-dhafka. Marka la isku soo wada duubo, xogteennu waxay muujinaysaa caqabadda ah in la caddeeyo kakanaanta farsamooyinka nidaaminaya dhaqdhaqaaqa mitochondrial. Waxaan iftiiminaynaa faa'iidada TEM ee barashada qaab-dhismeedka mitochondrial sida dhibicda isku-dhafka ah ee mitosis ee unugyada SH-SY5Y. Intaa waxaa dheer, waxaan iftiiminaynaa in xogta TEM ay bixiso macluumaadka ugu qanisan marka lagu daro farsamooyinka sawir-qaadista kuwaas oo sidoo kale qabta dhacdooyinka firfircoon si looga jawaabo walbahaarka dheef-shiid kiimikaadka. Sifeynta dheeraadka ah ee hababka nidaaminta molecular-ka ee taageera mitosis-ka unugyada neerfaha ayaa laga yaabaa inay bixiso aragti muhiim ah oo ku saabsan qaybta mitochondrial ee habdhiska neerfaha iyo cudurada neurodegenerative.
Si loo kiciyo cadaadiska mitochondrial, unugyada SH-SY5Y waxaa lagu daaweeyay PPA iyadoo la isticmaalayo 3 mM iyo 5 mM sodium propionate (NaP). Kahor TEM, muunado waxaa lagu sameeyay diyaarinta muunad cryogenic ah iyadoo la adeegsanayo qaboojinta iyo qaboojinta cadaadiska sare leh (Jaantuska 1a). Waxaan samaynay dhuumaha falanqaynta sawirka mitochondrial ee otomaatiga ah si loo cabbiro siddeed xuduudood oo qaab-dhismeed ah oo dadka mitochondrial ah oo ku kala yaal saddex nuqul oo bayooloji ah. Waxaan ogaanay in daaweynta PPA ay si weyn u beddeshay afar xuduudood: aagga 2, aagga, wareegga, iyo dhexroorka Feret (Jaantuska 1b–e). Aagga 2 si weyn ayuu hoos ugu dhacay iyadoo la adeegsanayo daaweynta PPA ee 3 mM iyo 5 mM labadaba (p = 0.0183 iyo p = 0.002, siday u kala horreeyaan) (Jaantuska 1b), halka aagga (p = 0.003), wareegga (p = 0.0106) iyo dhexroorka Feret dhammaantood ay si weyn hoos ugu dhaceen. Waxaa jiray hoos u dhac weyn (p = 0.0172) kooxda daaweynta 5 mM marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta (Jaantuska 1c–e). Hoos u dhac weyn oo ku yimid aagga iyo wareegga ayaa muujiyay in unugyada lagu daaweeyay 5 mM PPA ay lahaayeen mitochondria yar oo wareegsan, iyo in mitochondria-dan ay ka yar yihiin kuwa ku jira unugyada xakamaynta. Tani waxay sidoo kale la jaanqaadaysaa hoos u dhac weyn oo ku yimid dhexroorka Feret, halbeeg madax-bannaan oo tilmaamaya hoos u dhac ku yimid masaafada ugu weyn ee u dhaxaysa geesaha walxaha. Isbeddellada ku yimid qaab-dhismeedka ultra-qaabka cristae ayaa la arkay: cristae-gu wuxuu noqday mid aan si fiican u muuqan iyadoo la saameeyey cadaadiska PPA (Jaantuska 1a, guddiga B). Si kastaba ha ahaatee, dhammaan sawirrada si cad uma muujin qaab-dhismeedka ultra-qaabka cristae, sidaa darteed falanqayn tiro leh oo isbeddelladan ah lama fulin. Xogtan TEM waxay ka tarjumaysaa saddex xaaladood oo suurtagal ah: (1) PPA waxay xoojisaa kala-goynta ama waxay joojisaa isku-darka, taasoo keenta in mitochondria-da jirta ay yaraato cabbirka; (2) biogenesis-ka la xoojiyay wuxuu abuuraa mitochondria cusub, yar ama (3) wuxuu isku mar kiciyaa labada habba. Inkasta oo xaaladahan aan lagu kala saari karin TEM, isbeddellada qaab-dhismeedka ee muhiimka ah waxay muujinayaan isbeddellada homeostasis-ka mitochondrial iyo dhaqdhaqaaqa hoos yimaada cadaadiska PPA. Kadib waxaan sahaminay xuduudo dheeraad ah si aan u sii sharaxno dhaqdhaqaaqan iyo farsamooyinka suurtagalka ah ee hoos yimaada.
Dib-u-habeyn ku samee qaab-dhismeedka mitochondrial-ka ee Propionic acid (PPA). (a) Sawirrada gudbinta elektrooniga ee matalaadda gudbinta (TEM) oo muujinaya in cabbirka mitochondrial uu hoos u dhaco oo mitochondria uu noqdo mid yar oo wareegsan iyadoo la kordhinayo daaweynta PPA; 0 mM (aan la daaweyn), 3 mM iyo 5 mM, siday u kala horreeyaan. Fallaadhaha cas waxay muujinayaan mitochondria. (b–e) Unugyada SH-SY5Y ee lagu daweeyay PPA muddo 24 saacadood ah ayaa loo diyaariyey TEM natiijooyinkana waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo Fiji/ImageJ. Afar ka mid ah siddeedda cabbir waxay muujiyeen farqi weyn oo u dhexeeya unugyada xakamaynta (aan la daaweyn, 0 mM PPA) iyo unugyada la daweeyay (3 mM iyo 5 mM PPA). (b) Gobolka 2, (c) Bedka, (d) Wareegga, (e) Dhexroorka Feret. Falanqaynta hal-dhinac ah ee kala duwanaanshaha (xakamaynta iyo daaweynta) iyo tijaabada isbarbardhigga badan ee Dunnett ayaa loo isticmaalay si loo go'aamiyo kala duwanaanshaha muhiimka ah (p < 0.05). Dhibcaha xogtu waxay matalaan celceliska qiimaha mitochondrial ee unug kasta oo shaqsiyeed, baararka khaladkuna waxay matalaan celceliska ± SEM. Xogta la muujiyay waxay matalaan n = 3, ugu yaraan 24 unug halkii nuqul; wadarta 266 sawir ayaa la falanqeeyay; * waxay tilmaamaysaa p < 0.05, ** waxay tilmaamaysaa p < 0.01.
Si aan u sii sharaxno sida firfircoonida mitochondrial ay uga jawaabto PPA, waxaan ku rinjiyeynay mitochondria tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) waxaanan isticmaalnay mikroskoob waqti-lapse ah iyo falanqaynta MEL si aan u helno oo aan u cabbirno mitochondria 24 saacadood ka dib 3 iyo 5 mM PPA. Daaweynta dhacdooyinka kala-goynta iyo isku-dhafka. (Jaantuska 2a). Ka dib falanqaynta MEL, mitochondria waxaa si dheeraad ah loo falanqeeyay si loo qiyaaso tirada qaab-dhismeedka mitochondrial iyo mugga celcelis ahaan. Waxaan aragnay koror yar laakiin muhiim ah oo ku yimid tirada dhacdooyinka kala-goynta ee ka dhacaya 3 mM [4.9 ± 0.3 (p < 0.05)] marka la barbar dhigo kala-goynta [5.6 ± 0.3 (p < 0.05) )] iyo isku-dhafka [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] iyo isku-dhafka [5.4 ± 0.5 (p < 0.05)] 0.05)] dhacdooyinka <0.05)] ayaa si weyn loo kordhiyay 5 mM marka la barbar dhigo xakamaynta (Jaantuska 3b). Tirada mitochondria si weyn ayay u korodhay labada 3 [32.6 ± 2.1 (p < 0.05)] iyo 5 mM [34.1 ± 2.2 (p < 0.05)] (Sawirka 3c), halka mugga celceliska qaab-dhismeedka mitochondrial kasta uu is beddelin (Sawirka 3c). 3d). Marka la isku soo wada duubo, tani waxay soo jeedinaysaa in dib-u-habaynta dhaqdhaqaaqa mitochondrial ay u adeegto jawaab celin magdhow ah oo si guul leh u ilaalisa sharafta shabakadda mitochondrial. Kordhinta tirada dhacdooyinka kala-goysyada ee 3 mM PPA waxay soo jeedinaysaa in kororka tirada mitochondrial ay qayb ahaan sabab u tahay kala-goysyada mitochondrial, laakiin marka la eego in mugga mitochondrial ee celceliska uu yahay mid aan isbeddelin asal ahaan, bayogenesis looma diidi karo jawaab celin magdhow dheeraad ah. Si kastaba ha ahaatee, xogtani waxay la jaan qaadaysaa qaab-dhismeedka mitochondrial ee yar yar, wareegsan ee ay aragtay TEM waxayna sidoo kale muujinayaan isbeddello muhiim ah oo ku yimid dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee ay kicisay PPA.
Asiidhka Propionic (PPA) wuxuu kiciyaa dib-u-habaynta firfircoon ee mitochondrial si loo ilaaliyo daacadnimada shabakadda. Unugyada SH-SY5Y waa la beeray, waxaa lagu daaweeyay 3 iyo 5 mM PPA muddo 24 saacadood ah waxaana lagu rinjiyeeyay TMRE iyo Hoechst 33342 oo ay ku xigto falanqaynta MEL. (a) Sawirrada mikroskoobka ee waqtiga-waqtiga ah ee matalaya oo muujinaya midabka iyo saadaasha ugu badan ee laba-geesoodka ah ee waqtiga 2 (t2) xaalad kasta. Gobollada la xushay ee lagu tilmaamay sawir kasta oo laba-geesood ah ayaa la xoojiyay oo lagu soo bandhigay 3D saddex waqti oo kala duwan (t1-t3) si loo muujiyo dhaqdhaqaaqa waqti ka dib; dhacdooyinka isku-dhafka waxaa lagu iftiimiyay cagaar; dhacdooyinka kala-goynta waxaa lagu iftiimiyay cagaar. Lagu soo bandhigay casaan. (b) Tirada celceliska dhacdooyinka firfircoon xaalad kasta. (c) Tirada celceliska qaab-dhismeedka mitochondrial unug kasta. (d) Mugga celceliska (µm3) ee qaab-dhismeedka mitochondrial kasta unug kasta. Xogta la muujiyay waxay matashaa n = 15 unug koox kasta oo daaweyn ah. Baararka khaladaadka la muujiyay waxay matalaan celceliska ± SEM, baarka miisaanka = 10 μm, * p < 0.05.
Asiidhka Propionic (PPA) wuxuu sababaa joojinta qoraalka ee hidda-wadaha la xiriira firfircoonida mitochondrial. Unugyada SH-SY5Y waxaa lagu daaweeyay 3 iyo 5 mM PPA muddo 24 saacadood ah. Qiimaynta hidda-wadaha qaraabada ah waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo RT-qPCR waxaana loo beddelay B2M. Hiddo-wadaha bayogenesis-ka Mitochondrial (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 iyo (d) NFE2L2. Hiddo-wadaha isku-dhafka iyo kala-goysyada Mitochondrial (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 iyo (i) DRP1. Kala duwanaansho muhiim ah (p < 0.05) ayaa lagu tijaabiyay iyadoo la adeegsanayo hal-dhinac ANOVA (xakamaynta iyo daaweynta) iyo tijaabada isbarbardhigga badan ee Dunnett: * waxay tilmaamaysaa p < 0.05, ** waxay tilmaamaysaa p < 0.01, iyo **** waxay tilmaamaysaa p < 0.0001. Baararka waxay matalaan muujinta celceliska ± SEM. Xogta la muujiyay waxay matalaysaa n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2), iyo n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) oo ah kuwa bayoolojiga ah.
Xogta laga helay falanqaynta TEM iyo MEL waxay si wada jir ah u tilmaamaysaa in PPA ay beddesho qaab-dhismeedka iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial. Si kastaba ha ahaatee, farsamooyinkan sawir-qaadista ma bixiyaan aragti ku saabsan hababka hoose ee wada geeddi-socodkan. Sidaa darteed, waxaan baarnay muujinta mRNA ee sagaal nidaamiye oo muhiim ah oo ku saabsan dhaqdhaqaaqa mitochondrial, bayogenesis, iyo mitosis iyadoo laga jawaabayo daaweynta PPA. Waxaan qiyaasnay ​​myeloma oncogene-ka unugyada (cMYC), factor-ka neefsashada nukliyeerka (NRF1), factor-ka qoraalka mitochondrial 1 (TFAM), factor-ka qoraalka NFE2-sida BZIP (NFE2L2), borotiinka gastrin-sida 2 (STOML2), atrophy-ka neerfaha indhaha 1 (OPA1), Mitofusin 1 (MFN1), Mitofusin 2 (MFN2) iyo borotiinka la xiriira dynamin 1 (DRP1) ka dib 24 saacadood oo daaweyn ah oo lagu sameeyay 3 mM iyo 5 mM PPA. Waxaan aragnay 3 mM (p = 0.0053, p = 0.0415 iyo p < 0.0001, siday u kala horreeyaan) iyo 5 mM (p = 0.0031, p = 0.0233, p < 0.0001) daaweynta PPA. (Jaantuska 3a–c). Hoos u dhaca muujinta mRNA wuxuu ku xirnaa qiyaasta: muujinta cMYC, NRF1 iyo TFAM waxay hoos u dhacday 5.7, 2.6 iyo 1.9 jeer 3 mM, siday u kala horreeyaan, iyo 11.2, 3 iyo 2.2 jeer 5 mM. Taas bedelkeeda, hidda-wadaha bayogenesis-ka dhexe ee NFE2L2 lama beddelin wax diirad ah oo PPA ah, inkastoo isbeddel la mid ah oo ku tiirsan qiyaasta oo muujinaya hoos u dhac la arkay (Jaantuska 3d).
Waxaan sidoo kale baarnay muujinta hiddo-sidayaasha caadiga ah ee ku lug leh nidaaminta kala-goysyada iyo isku-dhafka. STOML2 waxaa loo maleynayaa inuu ku lug leeyahay isku-dhafka, mitophagy iyo bayogenesis, muuqaalkiisana si weyn ayaa loo yareeyay (p < 0.0001) 3 mM (isbeddel 2.4-laab ah) iyo 5 mM (isbeddel 2.8-laab ah) PPA (Jaantuska 1). 3d). Sidoo kale, muujinta hiddo-sidayaasha isku-dhafka OPA1 ayaa hoos u dhacday 3 mM (isbeddel 1.6-laab ah) iyo 5 mM (isbeddel 1.9-laab ah) PPA (p = 0.006 iyo p = 0.0024, siday u kala horreeyaan) (Jaantuska 3f). Si kastaba ha ahaatee, ma aanan helin farqi weyn oo ku saabsan muujinta hiddo-sidayaasha isku-dhafka MFN1, MFN2 ama hiddo-sidayaasha isku-dhafka DRP1 iyadoo la raacayo cadaadiska PPA 24-saacadood (Jaantuska 3g–i). Intaa waxaa dheer, waxaan ogaanay in heerarka afar borotiin oo isku-dhafan iyo kala-goys ah (OPA1, MFN1, MFN2 iyo DRP1) aysan isbeddelin xaalado isku mid ah (Jaantuska 4a-d). Waa muhiim in la ogaado in xogtani ay muujinayso hal dhibic oo waqti ah oo laga yaabo inaysan ka tarjumayn isbeddellada muujinta borotiinka ama heerarka dhaqdhaqaaqa inta lagu jiro marxaladaha hore ee walbahaarka PPA. Si kastaba ha ahaatee, hoos u dhac weyn oo ku yimid muujinta cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, iyo OPA1 waxay muujinayaan isbeddel weyn oo ku yimaada qoraalka dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial, bayogenesis, iyo dhaqdhaqaaqa. Intaa waxaa dheer, xogtani waxay iftiiminaysaa faa'iidada farsamooyinka sawir-qaadista si toos ah loogu barto isbeddellada xaaladda-dhammaadka ee shaqada mitochondrial.
Heerarka borotiinka isku-dhafka iyo fission factor isma beddelin ka dib daaweynta propionic acid (PPA). Unugyada SH-SY5Y waxaa lagu daaweeyay 3 iyo 5 mM PPA muddo 24 saacadood ah. Heerarka borotiinka waxaa lagu qiyaasey falanqaynta Western blot, heerarka muujintana waxaa loo caadiyeeyay guud ahaan borotiinka. Celceliska muujinta borotiinka iyo matalaadda Western blots ee bartilmaameedka iyo guud ahaan borotiinka ayaa la muujiyay. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Baararka waxay matalaan celceliska ± SEM, xogta la muujiyayna waxay matalaan n = 3 nuqul oo bayooloji ah. Isbarbardhigyo badan (p < 0.05) ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo falanqaynta hal-dhinac ee kala duwanaanshaha iyo tijaabada Dunnett. Jelka asalka ah iyo blot waxaa lagu muujiyay Jaantuska S1.
Cilladda Mitochondria waxay la xiriirtaa cudurrada nidaamka badan leh oo u dhexeeya cudurrada dheef-shiid kiimikaadka, wadnaha iyo murqaha ilaa cudurrada neerfaha1,10. Cudurro badan oo neerfaha iyo neerfaha keena ayaa lala xiriiriyaa cilladda mitochondrial, taasoo muujinaysa muhiimadda ay leeyihiin xubnahan inta ay maskaxda ku jirto. Cudurradan waxaa ka mid ah cudurka Parkinson, cudurka Alzheimer iyo ASD3,4,18. Si kastaba ha ahaatee, helitaanka unugyada maskaxda si loo barto cudurradan waa adag tahay, gaar ahaan heerka farsamada, taasoo ka dhigaysa nidaamyada moodeelka unugyada beddel lagama maarmaan ah. Daraasaddan, waxaan isticmaalnaa nidaamka moodeelka unugyada iyadoo la adeegsanayo unugyada SH-SY5Y ee lagu daweeyay PPA si dib loogu soo celiyo cilladda mitochondrial ee lagu arkay cudurrada neerfaha, gaar ahaan cudurrada autism spectrum. Isticmaalka qaabkan PPA si loo barto dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee neerfayaasha ayaa laga yaabaa inay bixiso aragti ku saabsan asalka ASD.
Waxaan sahaminay suurtagalnimada in la isticmaalo TEM si loo arko isbeddellada qaab-dhismeedka mitochondrial. Waa muhiim in la ogaado in TEM si sax ah loo isticmaalo si loo kordhiyo waxtarkeeda. Diyaarinta muunadaha cryo waxay u oggolaaneysaa ilaalin wanaagsan oo qaab-dhismeedka neerfaha iyadoo isla mar ahaantaas la hagaajinayo qaybaha unugyada iyo yareynta sameynta walxaha qadiimiga ah34. Iyada oo la raacayo tan, waxaan aragnay in unugyada SH-SY5Y ee u eg neerfaha ay leeyihiin organelles unugyo hoose oo aan isbeddelin iyo mitochondria dheer (Jaantuska 1a). Tani waxay iftiiminaysaa faa'iidada farsamooyinka diyaarinta cryogenic ee lagu baranayo qaab-dhismeedka mitochondrial ee moodooyinka unugyada neerfaha. Inkasta oo cabbiraadaha tirada ay muhiim u yihiin falanqaynta ujeeddada xogta TEM, weli ma jiro wax isku raacsan oo ku saabsan xuduudaha gaarka ah ee la cabbiri karo si loo xaqiijiyo isbeddellada qaab-dhismeedka mitochondrial. Iyada oo lagu saleynayo tiro badan oo daraasado ah oo si tiro ahaan ah u baaray qaab-dhismeedka mitochondrial17,31,32, waxaan samaynay dhuumaha falanqaynta sawirka mitochondrial ee otomaatiga ah kaas oo cabbira sideed xuduudood oo qaab-dhismeed, kuwaas oo kala ah: aagga, aagga2, saamiga muuqaalka, wareegga, wareegga, heerka, dhexroorka Feret. iyo wareegga.
Waxaa ka mid ah, PPA si weyn ayay u yareysay aagga 2, aagga, wareegga, iyo dhexroorka Feret (Jaantuska 1b–e). Tani waxay muujisay in mitochondria ay noqotay mid yar oo wareegsan, taas oo la jaanqaadaysa daraasado hore oo muujinaya hoos u dhac ku yimid aagga mitochondrial ka dib 72 saacadood oo cadaadis mitochondrial ah oo ay keentay PPA30. Astaamahan qaab-dhismeedka ayaa laga yaabaa inay tilmaamaan kala-goynta mitochondrial, oo ah hab lagama maarmaan ah si loo kala saaro qaybaha dhaawacan ee shabakadda mitochondrial si kor loogu qaado burburkooda iyada oo loo marayo mitophagy35,36,37. Dhanka kale, hoos u dhaca cabbirka mitochondrial celcelis ahaan waxaa lala xiriirin karaa kororka biogenesis, taasoo keenta sameynta mitochondria yar oo curdin ah. Kala-goynta ama biogenesis oo kordhay waxay u taagan tahay jawaab celin magdhow ah si loo ilaaliyo mitosis ka dhanka ah cadaadiska mitochondrial. Si kastaba ha ahaatee, koritaanka mitochondrial oo yaraaday, isku-darka oo xumaaday, ama xaalado kale lama saari karo.
In kasta oo sawirrada xallinta sare leh ee ay samaysay TEM ay u oggolaanayaan go'aaminta astaamaha qaab-dhismeedka heerka mitochondria shaqsiyeed, habkani wuxuu soo saaraa sawirro laba-geesood ah hal mar. Si loo barto jawaabaha firfircoon ee cadaadiska dheef-shiid kiimikaadka, waxaan ku rinjiyeynay mitochondria TMRE waxaanan isticmaalnay mikroskoob waqti-lug ah oo leh falanqaynta MEL, taas oo u oggolaanaysa muuqaal 3D ah oo wax-ku-ool ah oo isbeddel ah oo ku yimaada shabakadda mitochondrial waqti ka dib33,38. Waxaan aragnay isbeddello qarsoon laakiin muhiim ah oo ku yimid dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee hoos yimaada cadaadiska PPA (Jaantuska 2). 3 mM, tirada dhacdooyinka kala-goynta ayaa si weyn u kordhay, halka dhacdooyinka isku-darka ay ahaayeen kuwo la mid ah kantaroolka. Kordhinta tirada dhacdooyinka kala-goynta iyo isku-dhafka labadaba waxaa lagu arkay 5 mM PPA, laakiin isbeddelladani waxay ahaayeen kuwo qiyaastii saami ah, taasoo soo jeedinaysa in kinetics kala-goynta iyo isku-dhafka ay gaaraan dheelitirka heerarka sare (Jaantuska 2b). Celceliska mugga mitochondrial wuxuu ahaa mid aan isbeddelin labada 3 iyo 5 mM PPA, taasoo muujinaysa in daacadnimada shabakadda mitochondrial la ilaaliyay (Jaantuska 2d). Tani waxay ka tarjumaysaa awoodda shabakadaha mitochondrial ee firfircoon si ay uga jawaabaan cadaadiska dheef-shiid kiimikaadka fudud si ay si wax ku ool ah u ilaaliyaan homeostasis iyaga oo aan sababin kala-goynta shabakadda. 3 mM PPA, kororka kala-goysyada ayaa ku filan si kor loogu qaado u gudubka dheelitirka cusub, laakiin dib-u-habeyn kinetic oo qoto dheer ayaa loo baahan yahay si looga jawaabo walbahaarka ay keento heerarka sare ee PPA.
Tirada mitochondria way korodhay labada fiirsasho ee PPA, laakiin celceliska mugga mitochondrial si weyn uma uusan beddelin (Jaantuska 2c). Tani waxay sabab u noqon kartaa koror ku yimid biogenesis ama kala qaybsanaanta oo korodhay; si kastaba ha ahaatee, haddii aan la helin hoos u dhac weyn oo ku yimid celceliska mugga mitochondrial, waxay u badan tahay in biosynthesis uu kordho. Si kastaba ha ahaatee, xogta ku jirta Jaantuska 2 waxay taageertaa jiritaanka laba hab oo magdhow ah: koror tirada dhacdooyinka kala-goynta, oo la jaan qaadaya kor u qaadista kala-goynta mitochondrial, iyo kororka tirada dhacdooyinka, oo la jaanqaadaya bayogenesis-ka mitochondrial. Ugu dambeyntii, magdhowga firfircoon ee walaaca khafiifka ah wuxuu ka koobnaan karaa habab isku mar ah oo ku lug leh kala-goynta, isku-darka, bayogenesis-ka, iyo mitophagy. Inkasta oo qorayaashii hore ay muujiyeen in PPA ay xoojiso mitosis30,39 iyo mitophagy29, waxaan bixinaa caddayn dib-u-habeyn loogu sameeyo kala-goynta mitochondrial iyo dhaqdhaqaaqa isku-darka iyadoo laga jawaabayo PPA. Xogtani waxay xaqiijinaysaa isbeddellada qaab-dhismeedka ee ay aragtay TEM waxayna bixinaysaa aragti dheeraad ah oo ku saabsan farsamooyinka la xiriira cilladda mitochondrial-ka ee PPA ay keento.
Maadaama falanqaynta TEM iyo MEL midkoodna aysan bixin caddayn toos ah oo ku saabsan hababka nidaaminta hiddaha ee salka ku haya isbeddellada qaab-dhismeedka ee la arkay, waxaan baarnay muujinta RNA ee hidde-sideyaasha ku lug leh dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial, bayogenesis, iyo dhaqdhaqaaqa. CMYC proto-oncogene waa arrin qoraal ah oo ku lug leh nidaaminta mitochondria, glycolysis, amino acid iyo dheef-shiid kiimikaadka dufanka leh40. Intaa waxaa dheer, cMYC waxaa loo yaqaanaa inay nidaamiso muujinta ku dhawaad ​​​​600 oo hidde-sideyaal mitochondrial ah oo ku lug leh qoraalka mitochondrial, tarjumaadda, iyo isu-imaatinka adag, oo ay ku jiraan NRF1 iyo TFAM41. NRF1 iyo TFAM waa laba nidaamiye oo dhexe oo mitosis ah, oo ka shaqeeya hoos PGC-1α si ay u dhaqaajiso taranka mtDNA. Waddadani waxaa dhaqaajiya calaamadaynta cAMP iyo AMPK waxayna xasaasi u tahay kharashka tamarta iyo walbahaarka dheef-shiid kiimikaadka. Waxaan sidoo kale baarnay NFE2L2, oo ah nidaamiye redox ah oo bayogenesis mitochondrial ah, si loo go'aamiyo in saameynta PPA ay dhexdhexaadin karto walbahaarka oksaydhka.
In kasta oo muujinta NFE2L2 aysan isbeddelin, waxaan helnay hoos u dhac joogto ah oo ku xiran qiyaasta muujinta cMYC, NRF1 iyo TFAM ka dib 24 saacadood oo daaweyn ah oo lagu sameeyay 3 mM iyo 5 mM PPA (Sawirka 3a-c). Hoos u dhaca muujinta cMYC ayaa hore loogu soo sheegay inay tahay jawaab celin cadaadis mitochondrial42, taa beddelkeedana, hoos u dhaca muujinta cMYC waxay sababi kartaa cillad mitochondrial iyadoo dib loo habeynayo dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial, isku xirka shabakadda, iyo kala-goynta xuubka43. Waxaa xiiso leh, cMYC sidoo kale waxay ku lug leedahay nidaaminta kala-goynta mitochondrial iyo isku-darka42,43 waxaana la ogyahay inay kordhiso fosfoorasaydhka DRP1 iyo deegaanka mitochondrial inta lagu jiro qaybinta unugyada44, iyo sidoo kale dhexdhexaadinta dib-u-habaynta qaab-dhismeedka mitochondrial ee unugyada asliga ah ee neerfaha45. Runtii, fibroblasts-ka aan lahayn cMYC waxay muujinayaan cabbirka mitochondrial oo yaraaday, oo la jaan qaadaya isbeddellada ay keento cadaadiska PPA43. Xogtani waxay muujinaysaa xiriir xiiso leh laakiin aan weli caddayn oo u dhexeeya cMYC iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial, taasoo bixinaysa bartilmaameed xiiso leh oo loogu talagalay daraasadaha mustaqbalka ee dib-u-habaynta ay keento cadaadiska PPA.
Hoos u dhaca NRF1 iyo TFAM wuxuu la jaan qaadayaa doorka cMYC oo ah firfircooni qoraal oo muhiim ah. Xogtani waxay sidoo kale la jaanqaadaysaa daraasado hore oo lagu sameeyay unugyada kansarka mindhicirka aadanaha oo muujinaya in PPA ay yareysay muujinta NRF1 mRNA 22 saacadood, taas oo lala xiriiriyay yaraanta ATP iyo kororka ROS46. Qorayaashani waxay sidoo kale sheegeen in muujinta TFAM ay korodhay 8.5 saacadood laakiin ay ku soo laabatay heerarka aasaasiga ah 22 saacadood. Taas bedelkeeda, Kim et al. (2019) waxay muujiyeen in muujinta TFAM mRNA ay si weyn hoos ugu dhacday ka dib 4 saacadood oo walaac PPA ah oo ku jira unugyada SH-SY5Y; si kastaba ha ahaatee, ka dib 72 saacadood, muujinta borotiinka TFAM si weyn ayaa loo kordhiyay tirada nuqulka mtDNA-na si weyn ayaa loo kordhiyay. Sidaa darteed, hoos u dhaca tirada hiddo-wadaha bayogenesis-ka ee aan aragnay 24 saacadood ka dib kama saarayso suurtagalnimada in kororka tirada mitochondria uu la xiriiro kicinta bayogenesis-ka waqtiyadii hore. Daraasado hore ayaa muujiyay in PPA ay si weyn kor ugu qaaddo PGC-1α mRNA iyo borotiinka unugyada SH-SY5Y 4 saacadood iyo 30 daqiiqo, halka propionic acid ay kor u qaaddo bayogenesis-ka mitochondrial ee hepatocytes-ka kubka iyada oo loo marayo PGC-1α 12 saacadood iyo 39 daqiiqo. Waxaa xiiso leh, PGC-1α ma aha oo kaliya nidaamiye qoraal toos ah oo NRF1 iyo TFAM ah, laakiin sidoo kale waxaa la muujiyay inuu nidaamiyo dhaqdhaqaaqa MFN2 iyo DRP1 isagoo nidaaminaya kala-goynta iyo isku-darka47. Marka la isku soo wada duubo, tani waxay iftiiminaysaa isku-xidhka dhow ee farsamooyinka nidaaminaya jawaabaha magdhowga mitochondrial ee ay keento PPA. Intaa waxaa dheer, xogteennu waxay ka tarjumaysaa khalkhal weyn oo ku yimaada nidaaminta qoraalka ee bayogenesis-ka iyo dheef-shiid kiimikaadka iyadoo la raacayo cadaadiska PPA.
Hidde-sidayaasha STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 iyo DRP1 ayaa ka mid ah kuwa nidaamiya isku-xidhka mitochondrial-ka, isku-xidhka iyo dhaqdhaqaaqa37,48,49. Waxaa jira hiddo-sidayaal kale oo badan oo ku lug leh dhaqdhaqaaqa mitochondrial-ka, si kastaba ha ahaatee, STOML2, OPA1 iyo MFN2 ayaa hore loo ogaaday inay si kala duwan u kala duwan yihiin kooxaha ASD,16 iyo dhowr daraasadood oo madax-bannaan ayaa soo sheegay isbeddello ku yimid arrimahan qoraalka iyagoo ka jawaabaya cadaadiska mitochondrial50,51. 52. Muujinta labadaba OPA1 iyo STOML2 waxaa si weyn hoos ugu dhacay daaweynta 3 mM iyo 5 mM PPA (Sawirka 3e, f). OPA1 waa mid ka mid ah nidaamiyayaasha caadiga ah ee isku-xidhka mitochondrial-ka iyada oo loo marayo isdhexgalka tooska ah ee MFN1 iyo 2 waxayna door ka ciyaartaa dib-u-habaynta cristae iyo qaab-dhismeedka mitochondrial53. Doorka saxda ah ee STOML2 ee dhaqdhaqaaqa mitochondrial-ka weli ma cadda, laakiin caddayntu waxay soo jeedinaysaa inay door ka ciyaarto isku-xidhka mitochondrial-ka, bayogenesis, iyo mitophagy.
STOML2 waxay ku lug leedahay ilaalinta isku xidhka neefsashada ee mitochondrial iyo sameynta isku-dhafka silsiladda neefsashada54,55 waxaana la muujiyay inuu si qoto dheer u beddelo astaamaha dheef-shiid kiimikaadka ee unugyada kansarka56. Daraasaduhu waxay muujiyeen in STOML2 uu kor u qaado awoodda xuubka mitochondrial iyo bayogenesis iyada oo loo marayo isdhexgalka BAN iyo cardiolipin 55, 57, 58. Intaa waxaa dheer, daraasado madax-bannaan ayaa muujiyay in isdhexgalka u dhexeeya STOML2 iyo PINK1 uu nidaamiyo mitophagy59,60. Waxaa xusid mudan, STOML2 ayaa la sheegay inuu si toos ah ula falgalo oo uu xasiliyo MFN2 sidoo kalena uu door muhiim ah ka ciyaaro xasilinta isoforms-ka dheer ee OPA1 isagoo joojinaya protease-ka mas'uulka ka ah burburinta OPA153,61,62. Hoos u dhaca muujinta STOML2 ee lagu arkay falcelinta PPA waxay ka dhigi kartaa borotiinnada isku-dhafka inay u nugul yihiin burburka iyada oo loo marayo waddooyinka ubiquitin iyo proteasome-ka ku tiirsan48. In kasta oo doorka saxda ah ee STOML2 iyo OPA1 ee jawaabta firfircoon ee PPA aan caddayn, hoos u dhaca muujinta hiddo-sidayaashan isku-dhafka ah (Jaantuska 3) ayaa carqaladeyn kara dheelitirka u dhexeeya kala-goynta iyo isku-dhafka waxayna horseedi kartaa hoos u dhac cabbirka mitochondrial (Jaantuska 3). 1).
Dhanka kale, muujinta borotiinka OPA1 isma beddelin 24 saacadood ka dib, halka heerarka mRNA iyo borotiinka ee MFN1, MFN2 ama DRP1 aysan si weyn isu beddelin ka dib daaweynta PPA (Jaantuska 3g-i, Sawirka 4). Tani waxay muujin kartaa inaysan jirin wax isbeddel ah oo ku yimid nidaaminta arrimahan ku lug leh isku-dhafka iyo kala-goynta mitochondrial. Si kastaba ha ahaatee, waxaa xusid mudan in mid kasta oo ka mid ah afartan hidde-side ay sidoo kale nidaamiyaan wax-ka-beddelka qoraalka kadib (PTMs) kuwaas oo xakameeya dhaqdhaqaaqa borotiinka. OPA1 waxay leedahay siddeed nooc oo kala duwan oo kala-goyn ah oo si proteolytic ah loogu kala qaybiyay mitochondria si loo soo saaro laba isoforms oo kala duwan 63. Isku dheelitirka u dhexeeya isoforms-ka dheer iyo kuwa gaaban ugu dambeyntii wuxuu go'aamiyaa doorka OPA1 ee isku-darka mitochondrial iyo dayactirka shabakadda mitochondrial64. Waxqabadka DRP1 waxaa nidaamiya fosfoorasaydhka borotiinka ee kinase II (CaMKII) ee ku tiirsan kalsiyum/calmodulin, halka burburka DRP1 lagu nidaamiyo ubiquitination iyo SUMOylation65. Ugu dambeyntii, DRP1 iyo MFN1/2 labaduba waa GTPases, sidaa darteed dhaqdhaqaaqa waxaa saameyn kara heerka wax soo saarka GTP ee mitochondria 66. Sidaa darteed, inkastoo muujinta borotiinnadani ay joogto tahay, tani waxaa laga yaabaa inaysan muujinayn dhaqdhaqaaqa borotiinka aan isbeddelin ama deegaan ahaan67,68. Runtii, soo-saareyaasha borotiinka PTM ee jira badanaa waxay u adeegaan safka ugu horreeya ee difaaca mas'uulka ka ah dhexdhexaadinta jawaabaha walbahaarka degdegga ah. Iyadoo ay jirto walbahaarka dheef-shiid kiimikaadka dhexdhexaadka ah ee qaabkeenna, waxay u badan tahay in PTM ay kor u qaaddo dhaqdhaqaaqa kordhay ee borotiinnada isku-dhafka iyo kala-goysyada si ay si ku filan u soo celiyaan sharafta mitochondrial iyada oo aan loo baahnayn firfircooni dheeraad ah oo hidde-sidayaashan ah heerka mRNA ama borotiinka.
Marka la isku soo wada duubo, xogta kor ku xusan waxay iftiiminaysaa nidaaminta adag iyo waqtiga ku xiran ee qaab-dhismeedka mitochondrial iyo caqabadaha lagu sharraxayo hababkan. Si loo barto muujinta hidda-wadaha, marka hore waa lagama maarmaan in la aqoonsado hiddo-wadaha bartilmaameedka gaarka ah ee waddada. Si kastaba ha ahaatee, xogteennu waxay muujinaysaa in hiddo-wadaha ku jira isla waddada aysan si isku mid ah uga jawaabin walbahaarka isku midka ah. Dhab ahaantii, daraasado hore ayaa muujiyay in hiddo-wadaha kala duwan ee isla waddada ay muujin karaan astaamo jawaab celin oo kala duwan30,46. Intaa waxaa dheer, waxaa jira habab adag oo ka dambeeya qoraalka oo carqaladeeya xiriirka ka dhexeeya qoraalka iyo shaqada hidda-wadaha. Daraasadaha Proteomic waxay bixin karaan aragti ku saabsan saameynta PTM-yada iyo shaqada borotiinka, laakiin waxay sidoo kale keenaan caqabado ay ku jiraan hababka wax-soo-saarka hooseeya, saamiga calaamadaha-ilaa-qaylada sare, iyo xallinta liidata.
Xaaladdan, barashada qaab-dhismeedka mitochondrial iyadoo la adeegsanayo TEM iyo MEL waxay leedahay awood weyn oo ay wax uga qabato su'aalaha aasaasiga ah ee ku saabsan xiriirka ka dhexeeya dhaqdhaqaaqa mitochondrial iyo shaqada iyo sida tani u saamayso cudurka. Tan ugu muhiimsan, TEM waxay bixisaa hab toos ah oo lagu cabbiro qaab-dhismeedka mitochondrial sida barta isku-dhafka ah ee cillad-darrada mitochondrial iyo dhaqdhaqaaqa51. MEL waxay sidoo kale bixisaa hab toos ah oo lagu sawirayo dhacdooyinka kala-goysyada iyo isku-dhafka ee jawi unug oo saddex-geesood ah, taasoo u oggolaanaysa qiyaasidda dib-u-habaynta mitochondrial firfircoon xitaa haddii aysan jirin isbeddello ku yimaada muujinta hiddaha33. Halkan waxaan ku iftiiminaynaa faa'iidada farsamooyinka sawir-qaadista mitochondrial ee cudurrada labaad ee mitochondrial. Cudurradan waxaa caadi ahaan lagu gartaa walbahaarka dheef-shiid kiimikaadka ee khafiifka ah ee daba-dheeraada oo lagu garto dib-u-habaynta qarsoon ee shabakadaha mitochondrial halkii ay ka ahaan lahayd dhaawac daran oo mitochondrial ah. Si kastaba ha ahaatee, magdhowga mitochondrial ee loo baahan yahay si loo ilaaliyo mitosis-ka iyadoo la raacayo walbahaarka daba-dheeraada wuxuu leeyahay cawaaqib shaqo oo qoto dheer. Marka la eego neerfaha neerfaha, faham wanaagsan oo ku saabsan hababkan magdhowga ah ayaa laga yaabaa inay bixiyaan macluumaad muhiim ah oo ku saabsan neerfaha pleiotropic ee la xiriira cillad-darrada mitochondrial.
Ugu dambeyntii, xogteenu waxay iftiiminaysaa faa'iidada farsamooyinka sawir-qaadista si loo fahmo cawaaqib xumada shaqada ee isdhexgalka adag ee u dhexeeya muujinta hidda-wadaha, wax-ka-beddelka borotiinka, iyo dhaqdhaqaaqa borotiinka ee xakameeya dhaqdhaqaaqa mitochondrial-ka neerfaha. Waxaan u adeegsannay PPA si aan u qaabeyno cillad mitochondrial ah qaabka unugyada neerfaha si aan u helno aragti ku saabsan qaybta mitochondrial-ka ee ASD. Unugyada SH-SY5Y ee lagu daaweeyay PPA waxay muujiyeen isbeddello ku yimid qaab-dhismeedka mitochondrial: mitochondria waxay noqotay mid yar oo wareegsan, cristae-na si liidata ayaa loo qeexay markii lagu arkay TEM. Falanqaynta MEL waxay muujinaysaa in isbeddelladani ay dhacaan iyadoo lala socdo kororka dhacdooyinka kala-goynta iyo isku-dhafka si loo ilaaliyo shabakadda mitochondrial iyadoo laga jawaabayo cadaadiska dheef-shiid kiimikaadka fudud. Intaa waxaa dheer, PPA waxay si weyn u carqaladeyneysaa nidaaminta qoraalka ee dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial iyo homeostasis. Waxaan aqoonsannay cMYC, NRF1, TFAM, STOML2, iyo OPA1 inay yihiin nidaamiyeyaasha muhiimka ah ee mitochondrial ee ay carqaladeeyeen cadaadiska PPA waxayna door ka ciyaari karaan dhexdhexaadinta isbeddellada ay keento PPA ee qaab-dhismeedka iyo shaqada mitochondrial. Daraasadaha mustaqbalka ayaa loo baahan yahay si si wanaagsan loogu garto isbeddellada ku-meel-gaarka ah ee ay keento PPA ee muujinta hidda-wadaha iyo dhaqdhaqaaqa borotiinka, deegaanka, iyo wax-ka-beddelka ka dib tarjumaadda. Xogteenu waxay iftiiminaysaa kakanaanta iyo isku-tiirsanaanta hababka sharciyeynta ee dhexdhexaadinaya jawaabta walbahaarka mitochondrial waxayna muujinaysaa isticmaalka TEM iyo farsamooyinka kale ee sawir-qaadista ee daraasadaha farsamada ee bartilmaameedsan.
Khadka unugyada SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) waxaa laga soo iibsaday Sigma-Aldrich. Unugyada SH-SY5Y waxaa lagu beeray isku darka nafaqada dhexdhexaadka ah/F-12 ee Dulbecco (DMEM/F-12) iyo L-glutamine (SC09411, ScienCell) oo ku jira 25 cm2 oo lagu daray 20% serumka lo'da ee uurjiifka (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) iyo 1% penicillin-streptomycin (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) heerkul ah 37 °C, 5% CO2. Unugyada waxaa lagu beeray 80% isku-dhafan iyadoo la isticmaalayo 0.05% trypsin-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), oo lagu dhex beeray 300 g oo lagu dahaadhay cufnaan qiyaastii 7 × 105 unug/ml. Dhammaan tijaabooyinka waxaa lagu sameeyay unugyada SH-SY5Y ee aan kala sooc lahayn inta u dhaxaysa marinnada 19–22. PPA waxaa loo maamulaa sida NaP. Budada NaP (CAS No. 137-40-6, qaacidada kiimikada C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) oo ku jirta biyo diirran oo MilliQ ah ilaa heer kul ah 1 M oo ku kaydi 4 °C. Maalinta daawaynta, ku qas xalkan 1 M PPA ilaa 3 mM iyo 5 mM PPA oo ku jira dhexdhexaad aan seeram lahayn (DMEM/F-12 oo leh L-glutamine). Isugeynta daaweynta ee dhammaan tijaabooyinka ma jirin PPA (0 mM, kontorool), 3 mM, iyo 5 mM PPA. Tijaabooyinka waxaa lagu sameeyay ugu yaraan saddex nuqul oo bayooloji ah.
Unugyada SH-SY5Y waxaa lagu beeray dhalooyin 25 cm5 ah oo leh heer ah 5.5 × 105 unug/ml waxaana la koray 24 saacadood. Daawaynta PPA waxaa lagu daray dhalada ka hor 24 saacadood oo la beeray. Ururi kiniiniyada unugyada iyadoo la raacayo hab-raacyada dhaqameed ee unugyada naasleyda (kor lagu sharaxay). Dib ugu celi kiniinka unugyada 100 µl 2.5% glutaraldehyde, 1 × PBS oo ku kaydi 4 °C ilaa laga farsameeyo. Unugyada SH-SY5Y si kooban ayaa loo centrifugedeeyay si ay unugyada u jajabiyaan oo looga saaro 2.5% glutaraldehyde, xalka 1 × PBS. Dib ugu celi qashinka jel agarose 4% ah oo lagu diyaariyey biyo la safeeyey (saamiga agarose iyo mugga dhoobada waa 1:1). Qaybaha Agarose waxaa lagu dhejiyay shabagyo saxanno fidsan waxaana lagu dahaadhay 1-hexadecene ka hor inta aan la qaboojin cadaadiska sare. Muunadaha waxaa lagu qaboojiyey 100% acetone qalalan -90°C muddo 24 saacadood ah. Heerkulka ayaa markaa la gaarsiiyay -80°C waxaana lagu daray xal 1% osmium tetroxide iyo 0.1% glutaraldehyde ah. Muunado ayaa lagu kaydiyay -80°C muddo 24 saacadood ah. Intaa ka dib, heerkulka si tartiib tartiib ah ayaa loogu kordhiyay heerkulka qolka dhowr maalmood: laga bilaabo - 80°C ilaa - 50°C muddo 24 saacadood ah, ilaa - 30°C muddo 24 saacadood ah, ilaa - 10°C muddo 24 saacadood ah ugu dambayntiina ilaa heerkulka qolka.
Ka dib diyaarinta cryogenic, muunadaha waxaa lagu shubay resin waxaana la sameeyay qaybo aad u khafiif ah (qiyaastii 100 nm) iyadoo la isticmaalayo Leica Reichert UltracutS ultramicrotome (Leica Microsystems). Qaybaha waxaa lagu rinjiyeeyay 2% uranyl acetate iyo lead citrate. Muunado ayaa lagu arkay iyadoo la isticmaalayo mikroskoob elektaroonig ah oo FEI Tecnai 20 ah (ThermoFisher (oo hore u ahayd FEI), Eindhoven, Netherlands) oo ku shaqeeya 200 kV (gudbiyaha Lab6) iyo kamarad Gatan CCD (Gatan, UK) oo ku qalabaysan shaandhada tamarta Tridiem.
Ku celcelin farsamo kasta, ugu yaraan 24 sawir oo unugyo ah ayaa la helay, wadarta guud waa 266 sawir. Dhammaan sawirrada waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo macro-ka Gobolka ee Xiisaha leh (ROI) iyo macro-ka Mitochondria. Macro-ka mitochondrial wuxuu ku salaysan yahay hababka la daabacay17,31,32 wuxuuna u oggolaanayaa habaynta dufcaddii nus-otomaatigga ah ee sawirrada TEM ee Fiji/ImageJ69. Marka la soo koobo: sawirka waa la rogaa oo la rogaa iyadoo la isticmaalayo kala-goynta asalka kubbadda rogidda (radius 60 pixel) iyo shaandhada bandpass-ka FFT (iyadoo la isticmaalayo 60 iyo 8 pixels oo xuduud sare iyo hoose ah siday u kala horreeyaan) iyo xakamaynta xariiqda toosan oo leh dulqaad jihayn ah oo ah 5%. Sawirka la farsameeyay si toos ah ayaa loo xaddidaa iyadoo la adeegsanayo algorithm-ka entropy-ga ugu badan waxaana la soo saaraa maaskaro laba-geesood ah. Gobollada sawirka ee la xiriira ROI-yada gacanta lagu soo xulay ee sawirrada TEM cayriin ayaa la soo saaray, iyagoo tilmaamaya mitochondria oo ka reebaya xuubka balaasmaha iyo gobollada kale ee isbarbardhigga sare leh. ROI kasta oo la soo saaray, walxaha laba-geesoodka ah ee ka weyn 600 pixels ayaa la falanqeeyay, bedka walxaha, wareegga, faasasyada waaweyn iyo kuwa yaryar, dhexroorka Feret, wareegga, iyo wareegga ayaa la cabbiray iyadoo la adeegsanayo hawlaha cabbirka ee ku dhex jira Fiji/ImageJ. Ka dib Merrill, Flippo, iyo Strack (2017), bedka 2, saamiga dhinaca walxaha (saamiga dhidibka weyn ilaa kan yar), iyo qodobka qaabka (FF) ayaa laga xisaabiyay xogtan, halkaas oo FF = bedka 2/4pi x aagga. Qeexitaanka qaacidada parametric waxaa laga heli karaa Merrill, Flippo, iyo Strack (2017). Macros-yada la xusay waxaa laga heli karaa GitHub (fiiri Bayaanka Helitaanka Xogta). Celcelis ahaan, qiyaastii 5,600 oo walxood ayaa la falanqeeyay daaweynta PPA kasta, wadarta guud ahaan qiyaastii 17,000 oo walxood (xog lama muujin).
Unugyada SH-SH5Y waxaa la dhigay saxanno dhaqameed oo 8 qol ah (ThermoFisher, #155411) si loogu oggolaado inay dhegdheg yeeshaan habeenkii ka dibna lagu dhex daro TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) iyo Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). rinjiyeynta. Sawirada waxaa lagu helay iyadoo la isticmaalayo laysarka 405 nm iyo 561 nm muddo 10 daqiiqo ah, sawirro cayriin ahna waxaa lagu helay z-stacks oo ka kooban 10 micrographs sawir leh oo leh tallaabo az ah oo 0.2 μm ah oo u dhexeeya muuqaallada sawirrada 12 dhibcood oo xigay. Sawirada waxaa la ururiyay iyadoo la isticmaalayo madal Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 oo ah heer sare oo xallin ah (Carl Zeiss, Oberkochen, Jarmalka) iyadoo la isticmaalayo muraayad LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 ah. Sawirrada waxaa lagu falanqeeyay ImageJ iyadoo la adeegsanayo dhuumaha hore loo sharraxay iyo plugin-ka ImageJ si loo cabbiro dhacdooyinka isku-dhafka iyo kala-goysyada, tirada celceliska qaab-dhismeedka mitochondrial, iyo mugga celceliska mitochondrial halkii unug33. Macros-ka MEL waxaa laga heli karaa GitHub (fiiri Bayaanka Helitaanka Xogta).
Unugyada SH-SY5Y waxaa lagu beeray saxanno lix-god ah oo cufnaantoodu tahay 0.3 × 106 unug/mL muddo 24 saacadood ah ka hor daaweynta. RNA waxaa laga soo saaray iyadoo la adeegsanayo habka Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) iyadoo wax laga beddelayo: ku dar 300 μl oo ah RNA lysis buffer ceel kasta ka hor inta aan la saarin oo muunad kasta ku shaandhee tallaabo kama dambays ah oo leh 30 μl oo biyo ah oo aan lahayn DNase/RNase. Dhammaan muunadaha waxaa lagu hubiyay tirada iyo tayada iyadoo la isticmaalayo NanoDrop ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer. Wadarta borotiinka laga helay unugyada lysates waxaa lagu helay iyadoo la isticmaalayo 200 μl RIPA lysis buffer, waxaana la cabbiray fiirsashada borotiinka iyadoo la adeegsanayo baaritaanka borotiinka Bradford70.
Sameynta cDNA waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) sida ku cad tilmaamaha soo saaraha iyadoo wax laga beddelayo. cDNA waxaa lagu sameeyay falgallo 20-μl ah iyadoo la adeegsanayo 0.7 ilaa 1 μg oo ah wadarta RNA. Astaamaha hore waxaa laga soo xulay waraaqo hore loo daabacay 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Jadwalka S1) baaritaannada la socdana waxaa loo qaabeeyey iyadoo la adeegsanayo qalabka PrimerQuest ee ka socda Teknolojiyada DNA-da ee Isku-dhafan. Dhammaan hiddo-wadaha xiisaha leh waxaa loo beddelay hiddo-wadaha B2M ee nukliyeerka. Muujinta hidda-wadaha ee STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC iyo OPA1 waxaa lagu cabbiray RT-qPCR. Isku darka ugu weyn waxaa ka mid ahaa LUNA Taq polymerase (M3003L, New England Biolabs), 10 μM oo ah rinjiyeynta hore iyo gadaal, cDNA, iyo biyaha heerka PCR si ay u soo saaraan mugga ugu dambeeya ee 10 μL falcelin kasta. Muujinta hidde-sideyaasha kala-qaybinta iyo kala-goynta (DRP1, MFN1/2) waxaa lagu cabiray iyadoo la adeegsanayo tijaabooyinka kala-qaybinta iyo kala-goynta TaqMan. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) ayaa loo isticmaalay iyadoo la raacayo tilmaamaha soo saaraha iyadoo wax laga beddelayo yar yar. Isku darka ugu badan ee RT-qPCR waxaa ku jira 1X LUNA Taq polymerase, 10 μM oo ah rinjiyeynta hore iyo gadaal, 10 μM oo ah baaritaan, cDNA, iyo biyo heerka PCR ah, taasoo keentay mugga ugu dambeeya ee 20 μL falcelin kasta. RT-qPCR waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG—lambarka taxanaha: R0618110). Xaaladaha baaskiilka waxaa lagu muujiyay Shaxda S1. Dhammaan muunadaha cDNA waxaa lagu kordhiyay saddex-laab waxaana la sameeyay qalooc caadi ah iyadoo la adeegsanayo taxane ah oo isku-darka toban laab ah. Waxyaabaha ka baxsan muunadaha saddex-laabka ah ee leh isbeddelka heerka wareegga (Ct) >0.5 ayaa laga saaray falanqaynta si loo hubiyo in xogta la soo saari karo30,72. Muujinta hidda-wadaha qaraabada ah waxaa lagu xisaabiyay habka 2-ΔΔCt79.
Shaybaarada borotiinka (60 μg) waxaa lagu qasay kaydka culeyska Laemmli oo ah saamiga 2:1 waxaana lagu socodsiiyay jel borotiin ah oo aan midab lahayn oo 12% ah (Bio-Rad #1610184). Borotiinnada waxaa loo wareejiyay xuubka PVDF (polyvinylidene fluoride) (#170-84156, Bio-Rad) iyadoo la adeegsanayo nidaamka Trans-Blot Turbo (#170-4155, Bio-Rad). Xuubka waa la xannibay oo lagu dhex daray unugyada difaaca jirka ee aasaasiga ah ee ku habboon (OPA1, MFN1, MFN2, iyo DRP1) (lagu qasay 1:1000) muddo 48 saacadood ah, ka dibna waxaa lagu dhex daray unugyada difaaca jirka ee labaad (1:10,000) muddo 1 saac ah. Xuubka waxaa markaa lagu sawiray iyadoo la isticmaalayo Clarity Western ECL Substrate (#170-5061, Bio-Rad) waxaana lagu duubay iyadoo la isticmaalayo nidaamka Bio-Rad ChemiDoc MP. Nooca ImageLab 6.1 waxaa loo isticmaalay falanqaynta Western blot. Jelka asalka ah iyo blot-ka waxaa lagu muujiyay Jaantuska S1. Macluumaadka antibody-ga waxaa lagu bixiyay Shaxda S2.
Xogta waxaa loo soo bandhigay inay tahay qaladka celceliska iyo heerka caadiga ah ee celceliska (SEM) ee ugu yaraan saddex muunadood oo madax-bannaan. Xogta waxaa lagu tijaabiyay caadi ahaan iyadoo la adeegsanayo tijaabada Shapiro-Wilks (haddii aan si kale loo sheegin) ka hor inta aan la qaadan qaybinta Gaussian iyo kala-duwanaanshaha heerka oo siman oo la sii wado falanqaynta. Intaa waxaa dheer falanqaynta xogta iyadoo la adeegsanayo Fisher's MEL LSD (p < 0.05), hal-dhinac ANOVA (daaweynta iyo celceliska xakamaynta), iyo tijaabada isbarbardhigga badan ee Dunnett si loo go'aamiyo muhiimadda (p < 0.05). Qiimaha p ee muhiimka ah waxaa lagu muujiyay garaafka sida *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Dhammaan falanqaynta tirakoobka iyo garaafyada waxaa la sameeyay oo la soo saaray iyadoo la adeegsanayo GraphPad Prism 9.4.0.
Macros-ka Fiji/ImageJ ee falanqaynta sawirka TEM waxaa si guud looga heli karaa GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Macro-ka Mitochondrial Event Locator (MEL) waxaa si guud looga heli karaa GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM iyo Vijaya A. Mitochondria: maamulayaasha ugu waaweyn ee dheef-shiid kiimikaadka, homeostasis-ka, walbahaarka, gabowga iyo epigenetics-ka. Indonesian. Sayniska Bayoolajiga. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Cilad-darro badan oo mitochondrial ah oo ku dhacda shisoofrani, isku-dhafan I oo ah bartilmaameed cudur oo suurtagal ah. Shisoofrani. kheyraad. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. iyo Beal, MF Cilad-darrada Mitochondrial ee cudurka Parkinson. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Sharma VK, Singh TG iyo Mehta V. Mitochondria oo walwalsan: bartilmaameedyada duullaanka cudurka Alzheimers. Mitochondria 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF iyo Ferreira GK Mitochondria iyo maskaxda: tamarta bayoolojiga iyo waxyaabo kaloo badan. Neurotoxins. kheyraad. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. et al. Mitokondria Pleiotropic: saameynta mitochondria ee horumarka neerfaha iyo cudurrada. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. iyo Morais, VA Bayoolojiga Mitochondrial ee neerfaha: sida iyo meesha. caalaminimada. J. Mohr. sayniska. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. iyo Zhao, J. Nidaaminta dhaqdhaqaaqa mitochondrial-ka naasleyda: fursadaha iyo caqabadaha. hore. endocrine. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. iyo Slack, RS Dhaqdhaqaaqa Mitochondrial ee nidaaminta neerfaha: laga bilaabo maskaxda koraysa ilaa maskaxda qaangaarka ah. horumarka. firfircoonida. 247, 47–53 (2018).