Waxaan hore u soo sheegnay in heerarka serum-ka ee metabolite-ka tryptophan ee laga helo mindhicirka indole-3-propionic acid (IPA) ay ka hooseeyaan bukaanada qaba fibrosis beerka. Daraasaddan, waxaan ku baarnay transcriptome iyo DNA methylome ee beerka cayilan marka loo eego heerarka IPA ee serum-ka, iyo sidoo kale doorka IPA ee kicinta joojinta phenotypic ee unugyada stellate-ka beerka (HSCs) gudaha vitro.
Daraasadda waxaa ku jiray 116 bukaan oo cayilan oo aan lahayn nooca 2aad ee sonkorowga mellitus (T2DM) (da'doodu tahay 46.8 ± 9.3 sano; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m²) kuwaas oo qalliin bariatric ah ku maray Xarunta Qalliinka Kuopio Bariatric (KOBS). Heerarka IPA ee wareegaya waxaa lagu cabiray dareere chromatography-mass spectrometry (LC-MS), falanqaynta beerka ee transcriptionome waxaa lagu sameeyay isku xigxiga RNA ee guud, falanqaynta methylation-ka DNA-da waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Unugyada stellate-ka beerka ee aadanaha (LX-2) ayaa loo isticmaalay tijaabooyinka in vitro.
Heerarka IPA ee serum-ka waxay la xiriiraan muujinta hiddo-sideyaasha ku lug leh marinnada apoptotic, mitophagic, iyo cimriga dheer ee beerka. Hiddo-sideyaasha AKT serine/threonine kinase 1 (AKT1) waxay ahaayeen hiddo-sideyaasha ugu badan uguna awoodda badan ee is-dhexgalka ee ku jira qoraalka beerka iyo astaamaha methylation-ka DNA-da. Daaweynta IPA waxay keentay apoptosis, hoos u dhaca neefsashada mitochondrial, iyo isbeddelka qaab-dhismeedka unugyada iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial iyadoo la beddelayo muujinta hiddo-sideyaasha loo yaqaan inay xakameeyaan fibrosis, apoptosis, iyo badbaadada unugyada LX-2.
Marka la isku soo wada duubo, xogtani waxay taageertaa in IPA ay leedahay saameyn daaweyn oo suurtagal ah waxayna kicin kartaa apoptosis waxayna u wareejin kartaa nooca HSC xaalad aan firfircoonayn, taasoo kordhinaysa suurtagalnimada in la joojiyo fibrosis beerka iyadoo faragelinaysa dhaqdhaqaaqa HSC iyo dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial.
Baahsanaanta cayilka iyo cilladda dheef-shiid kiimikaadka ayaa lala xiriiriyay kororka dhacdooyinka cudurka beerka dufanka leh ee la xiriira dheef-shiid kiimikaadka (MASLD); cudurku wuxuu saameeyaa 25% ilaa 30% dadweynaha guud [1]. Cawaaqibka ugu weyn ee asalka MASLD waa fibrosis beerka, oo ah geedi socod firfircoon oo lagu garto ururinta joogtada ah ee fibrous extracellular matrix (ECM) [2]. Unugyada ugu muhiimsan ee ku lug leh fibrosis beerka waa unugyada stellate hepatic (HSCs), kuwaas oo muujiya afar nooc oo la yaqaan: quiescent, activated, inactivated, iyo senescent [3, 4]. HSCs waa la kicin karaa oo laga beddeli karaa qaab quescent ah una gudbi karaa unugyo fibroblast u eg oo leh baahiyo tamar sare leh, iyadoo la kordhinayo muujinta actin muruqa α-smooth (α-SMA) iyo collagen nooca I (Col-I) [5, 6]. Inta lagu jiro dib-u-noqoshada fibrosis beerka, HSCs-ka firfircoon waxaa lagu baabi'iyaa apoptosis ama joojin. Hawshani waxaa ka mid ah hoos u dhigista hiddo-sidayaasha fibrogenic iyo habaynta hiddo-sidayaasha badbaadada (sida NF-κB iyo PI3K/Akt signal pathways) [7, 8], iyo sidoo kale isbeddellada ku yimaada dhaqdhaqaaqa mitochondrial iyo shaqada [9].
Heerarka serum-ka ee metabolite-ka tryptophan indole-3-propionic acid (IPA), oo laga soo saaro xiidmaha, ayaa la ogaaday inay hoos u dhaceen cudurrada dheef-shiid kiimikaadka aadanaha oo ay ku jiraan MASLD [10-13]. IPA waxay la xiriirtaa qaadashada fiber-ka cuntada, waxaa loo yaqaanaa saamaynta antioxidant-ka iyo ka-hortagga bararka, waxayna yareysaa nooca steatohepatitis-ka aan khamriga ahayn (NASH) ee ku dhaca vivo iyo in vitro [11-14]. Caddeymo qaar ayaa ka yimid daraasaddeenna hore, taasoo muujisay in heerarka IPA ee serum-ka ay ka hooseeyaan bukaanada qaba fibrosis-ka beerka marka loo eego bukaanada cayilan ee aan lahayn fibrosis-ka beerka ee Daraasadda Qalliinka Kuopio Bariatric (KOBS). Intaa waxaa dheer, waxaan tusnay in daaweynta IPA ay yareyn karto muujinta hidda-wadaha kuwaas oo ah calaamadaha caadiga ah ee isku-xidhka unugyada, socdaalka unugyada iyo dhaqdhaqaaqa unugyada asliga ah ee hematopoietic ee qaabka unugyada stelate-ka beerka aadanaha (LX-2) waana metabolite-ka difaaca beerka ee suurtagalka ah [15]. Si kastaba ha ahaatee, weli ma cadda sida IPA ay u kiciso dib-u-noqoshada fibrosis-ka beerka iyadoo kicinaysa apoptosis-ka HSC iyo bioenergetics-ka mitochondrial.
Halkan, waxaan ku tusinaynaa in IPA serum-ka uu la xiriiro muujinta hiddo-sideyaasha ku hodansan apoptosis, mitophagy, iyo waddooyinka cimriga dheer ee beerka ee shakhsiyaadka cayilan laakiin aan ahayn nooca 2aad ee sonkorowga (KOBS). Intaa waxaa dheer, waxaan ogaanay in IPA ay kicin karto nadiifinta iyo burburinta unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSCs) iyada oo loo marayo marin-haweedka joojinta. Natiijooyinkani waxay muujinayaan door cusub oo loogu talagalay IPA, taasoo ka dhigaysa bartilmaameed daaweyn oo suurtagal ah si kor loogu qaado dib-u-noqoshada fibrosis-ka beerka.
Daraasad hore oo lagu sameeyay kooxda KOBS ayaa muujisay in bukaanada qaba fibrosis beerka ay lahaayeen heerar hoose oo IPA ah marka la barbar dhigo bukaanada aan lahayn fibrosis beerka [15]. Si looga saaro saameynta jahwareerka leh ee sonkorowga nooca 2, waxaan qornay 116 bukaan oo cayilan oo aan lahayn sonkorowga nooca 2 (da'da celceliska ± SD: 46.8 ± 9.3 sano; BMI: 42.7 ± 5.0 kg/m2) (Jadwalka 1) daraasadda socota ee KOBS iyadoo ah dadka daraasadda [16]. Dhammaan ka qaybgalayaashu waxay bixiyeen ogolaansho qoraal ah oo wargelin ah, hab-raaca daraasaddana waxaa ansixiyay Guddiga Anshaxa ee Isbitaalka Degmada North Savo iyadoo la raacayo Baaqa Helsinki (54/2005, 104/2008 iyo 27/2010).
Shaybaarada baaritaanka beerka waxaa la helay intii lagu jiray qalliinka bariatric waxaana si histological ah u qiimeeyay dhakhaatiirta khibradda leh ee cudurrada iyadoo la raacayo shuruudaha hore loo sharraxay [17, 18]. Shuruudaha qiimeynta waxaa lagu soo koobay Jadwalka Dheeraadka ah ee S1 waxaana hore loogu sharraxay [19].
Shaybaarada soonka ee seeramka waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo spectrometry dareere ah oo aan la beegsanayn oo lagu cabbiro tirada unugyada (LC-MS) si loo sameeyo falanqaynta dheef-shiid kiimikaadka (n = 116). Shaybaarada waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo nidaamka UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Jarmalka) sida hore loogu sharraxay19. Aqoonsiga khamriga isopropyl (IPA) wuxuu ku salaysnaa waqtiga haynta iyo isbarbardhigga spectrum-ka MS/MS oo leh heerarka saafiga ah. Xoogga calaamadda IPA (meesha ugu sarreysa) ayaa lagu tixgeliyey dhammaan falanqaynta dheeraadka ah [20].
Taxanaha RNA ee beerka oo dhan waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Illumina HiSeq 2500 xogtana waa la sii farsameeyay sidii hore loogu sharraxay [19, 21, 22]. Waxaan sameynay falanqayn kala duwan oo ku saabsan qoraallada saameeya shaqada/bayoogenesis-ka mitochondrial iyadoo la adeegsanayo hiddo-sideyaal 1957 ah oo laga soo xulay xogta MitoMiner 4.0 [23]. Falanqaynta methylation-ka DNA-da beerka waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA) iyadoo la adeegsanayo isla habka hore loogu sharraxay [24, 25].
Unugyada stellate-ka beerka ee aadanaha (LX-2) waxaa si naxariis leh u bixiyay Prof. Stefano Romeo waxaana lagu beeray oo lagu hayay dhexdhexaadka DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Si loo doorto qiyaasta shaqada ee IPA, unugyada LX-2 waxaa lagu daaweeyay xoogag kala duwan oo IPA ah (10 μM, 100 μM iyo 1 mM; Sigma, 220027) oo ku jira dhexdhexaadka DMEM/F12 muddo 24 saacadood ah. Intaa waxaa dheer, si loo baaro awoodda IPA ay u joojin karto HSCs, unugyada LX-2 waxaa si wadajir ah loogu daaweeyay 5 ng/ml TGF-β1 (nidaamyada R&D, 240-B-002/CF) iyo 1 mM IPA oo ku jira dhexdhexaad aan seeram lahayn muddo 24 saacadood ah. Xakamaynta gaadiidka ee u dhiganta, 4 nM HCL oo ka kooban 0.1% BSA ayaa loo isticmaalay daaweynta TGF-β1 iyo 0.05% DMSO ayaa loo isticmaalay daaweynta IPA, labadaba waxaa loo isticmaalay daaweynta isku dhafan.
Apoptosis-ka waxaa lagu qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo Qalabka Ogaanshaha Apoptosis-ka ee FITC Annexin V oo leh 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, USA, Cat# 640922) sida ku cad tilmaamaha soo saaraha. Si kooban, LX-2 (1 × 105 unug/ceel) ayaa habeenkii lagu beeray saxanno 12-ceel ah ka dibna waxaa lagu daaweeyay qiyaaso badan oo IPA ama IPA iyo TGF-β1 ah. Maalintii xigtay, unugyada sabeynaya iyo kuwa ku dheggan ayaa la soo ururiyay, la trypsin gareeyay, lagu dhaqay PBS, dib loogu xiray kaydiyaha isku xidha Annexin V, ka dibna lagu dhex geliyay FITC-Annexin V iyo 7-AAD muddo 15 daqiiqo ah.
Mitochondria ee unugyada nool waxaa lagu rinjiyeeyay firfircoonida oksaydhka iyadoo la adeegsanayo Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Baaritaannada MTR, unugyada LX-2 waxaa lagu kululeeyay cufnaan isku mid ah oo leh IPA iyo TGF-β1. 24 saacadood ka dib, unugyada nool ayaa la isku dayay, lagu dhaqay PBS, ka dibna lagu kululeeyay 100 μM MTR oo ku jira dhexdhexaad aan seeram lahayn heerkul ah 37 °C muddo 20 daqiiqo ah sida hore loogu sharraxay [26]. Falanqaynta qaab-dhismeedka unugyada nool, cabbirka unugyada iyo kakanaanta cytoplasmic waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo xuduudaha kala firdhinta hore (FSC) iyo kala firdhinta dhinaca (SSC), siday u kala horreeyaan.
Dhammaan xogta (30,000 oo dhacdo) waxaa lagu helay iyadoo la adeegsanayo NovoCyte Quanteon (Agilent) waxaana lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka NovoExpress® 1.4.1 ama FlowJo V.10.
Heerka isticmaalka oksijiinta (OCR) iyo heerka aashitada ka baxsan unugyada (ECAR) ayaa lagu cabbiray waqtiga dhabta ah iyadoo la adeegsanayo Falanqeeyaha Flux Extracellular (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) oo lagu qalabeeyay Seahorse XF Cell Mito Stress sida ku cad tilmaamaha soo saaraha. Si kooban, 2 × 104 LX-2 unug/ceel ayaa lagu beeray saxannada dhaqanka unugyada XF96. Ka dib markii habeenkii la beeray, unugyada waxaa lagu daaweeyay isopropanol (IPA) iyo TGF-β1 (Hababka Dheeraadka ah 1). Falanqaynta xogta waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka Seahorse XF Wave, oo ay ku jiraan Soo-saare Warbixinta Tijaabada Tamarta Unugyada Seahorse XF. Laga soo bilaabo tan, waxaa la xisaabiyay Tusmada Caafimaadka Bioenergetic (BHI) [27].
Wadarta RNA waxaa loo beddelay cDNA. Si aad u hesho habab gaar ah, fiiri tixraaca [15]. Heerarka borotiinka aashitada ah ee Human 60S P0 (RPLP0) iyo cyclophilin A1 (PPIA) mRNA ayaa loo isticmaalay sidii xakamaynta hidda-wadaha ee isku-dhafan. Nidaamka PCR-ga ee QuantStudio 6 pro Real-Time (Thermo Fisher, Landsmeer, Netherlands) waxaa loo isticmaalay Qalabka Isku-darka Master-ka ee TaqMan™ Fast Advanced (Applied Biosystems) ama Qalabka Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), laabka muujinta hidda-wadaha ee qaraabada ahna waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo xuduudaha wareegga qiimaha Ct ee isbarbardhigga ah (ΔΔCt) iyo habka ∆∆Ct. Faahfaahinta astaamaha waxaa lagu bixiyay Jadwalka Dheeraadka ah S2 iyo S3.
DNA-da nukliyeerka (ncDNA) iyo mitochondrial DNA (mtDNA) ayaa laga soo saaray iyadoo la adeegsanayo qalabka dhiigga iyo unugyada DNeasy (Qiagen) sida hore loogu sharraxay [28]. Tirada qaraabada ah ee mtDNA waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la xisaabinayo saamiga gobol kasta oo mtDNA bartilmaameed ah ilaa celceliska joomatari ee saddexda gobol ee DNA-da nukliyeerka (mtDNA/ncDNA), sida lagu faahfaahiyay Hababka Dheeraadka ah 2. Faahfaahinta astaamaha aasaasiga ah ee mtDNA iyo ncDNA waxaa lagu bixiyay Shaxda Dheeraadka ah S4.
Unugyada nool waxaa lagu rinjiyeeyay Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) si loo sawiro shabakadaha mitochondrial-ka ee unugyada iyo unugyada. Unugyada LX-2 (1 × 104 unug/ceel) ayaa lagu beeray sawirro galaas ah oo ku yaal saxanno dhaqameed oo galaas ku yaal oo u dhigma (Ibidi GmbH, Martinsried, Jarmalka). 24 saacadood ka dib, unugyada LX-2 ee nool waxaa lagu kululeeyay 100 μM MTR muddo 20 daqiiqo ah heerkul ah 37 °C nuclei-gana waxaa lagu rinjiyeeyay DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) sida hore loogu sharraxay [29]. Shabakadaha Mitochondrial waxaa lagu sawiray iyadoo la isticmaalayo mikroskoobka Zeiss Axio Observer oo la rogay (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jarmalka) oo ku qalabaysan module Zeiss LSM 800 confocal ah oo ah 37 °C jawi qoyan oo leh 5% CO2 iyadoo la isticmaalayo ujeedo 63 × NA 1.3 ah. Waxaan helnay toban sawir oo taxane Z ah nooc kasta oo muunad ah. Taxane kasta oo Z ah wuxuu ka kooban yahay 30 qaybood, mid walbana dhumucdiisu waa 9.86 μm. Muunad kasta, sawirro toban goobood oo kala duwan oo muuqaal ah ayaa laga helay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Jarmalka), falanqaynta qaab-dhismeedka mitochondrial-na waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka ImageJ (v1.54d) [30, 31] iyadoo la raacayo xuduudaha lagu faahfaahiyay Hababka Dheeraadka ah 3.
Unugyada waxaa lagu hagaajiyay 2% glutaraldehyde oo ku jirta 0.1 M phosphate buffer, ka dibna waxaa lagu hagaajiyay 1% osmium tetroxide xal (Sigma Aldrich, MO, USA), si tartiib tartiib ah ayaa loogu qalajiyay acetone (Merck, Darmstadt, Germany), ugu dambeyntiina waxaa lagu daray epoxy resin. Qaybaha aadka u khafiifsan waxaa la diyaariyey oo lagu rinjiyeeyay 1% uranyl acetate (Merck, Darmstadt, Germany) iyo 1% lead citrate (Merck, Darmstadt, Germany). Sawirrada Ultrastructural waxaa laga helay iyadoo la isticmaalayo mikroskoob elektaroonig ah oo gudbinta JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tokyo, Japan) oo leh danab dardargelin ah oo ah 80 kV.
Qaab-dhismeedka unugyada LX-2 ee lagu daweeyay IPA muddo 24 saacadood ah ayaa lagu falanqeeyay mikroskoobka isbarbardhigga marxaladda oo leh 50x weyneyn iyadoo la adeegsanayo mikroskoobka iftiinka ee Zeiss rogan (Zeiss Axio Vert.A1 iyo AxioCam MRm, Jena, Jarmalka).
Xogta kiliinikada waxaa lagu muujiyay celcelis ahaan ± leexashada heerka ama dhexdhexaadka (kala duwanaanshaha isku-dhafka ah: IQR). Falanqaynta hal-dhinac ee kala duwanaanshaha (doorsoomayaasha joogtada ah) ama tijaabada χ² (doorsoomayaasha kala-soocidda) ayaa loo isticmaalay in lagu barbardhigo kala duwanaanshaha u dhexeeya saddexda kooxood ee daraasadda. Heerka beenta ah ee togan (FDR) ayaa loo isticmaalay in lagu saxo baaritaanno badan, hiddo-wadaha leh FDR < 0.05 waxaa loo tixgeliyey inay muhiimad tirakoob ahaan muhiim tahay. Falanqaynta isku-xirka Spearman waxaa loo isticmaalay in lagu xiriiriyo methylation-ka DNA-da CpG iyo xoojinta calaamadaha IPA, iyadoo qiimaha p ee magacaaban (p < 0.05) la soo sheegay.
Falanqaynta Waddada waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo qalab falanqayn hidde-side ku salaysan shabakadda (WebGestalt) oo loogu talagalay 268 qoraal (magaca p < 0.01), 119 qoraal oo la xiriira mitochondria (magaca p < 0.05), iyo 4350 CpGs oo ka mid ah 3093 qoraal oo beerka ah oo lala xiriiriyay heerarka IPA ee wareegga dhiigga. Qalabka Venny DB (nooca 2.1.0) ee si xor ah loo heli karo ayaa loo isticmaalay in lagu helo hiddo-sideyaal is dulsaaran, StringDB (nooca 11.5) waxaa loo isticmaalay in lagu sawiro isdhexgalka borotiinka-borotiin.
Tijaabada LX-2, muunado ayaa lagu tijaabiyay caadi ahaan iyadoo la adeegsanayo tijaabada D'Agostino-Pearson. Xogta waxaa laga helay ugu yaraan saddex nuqul oo bayooloji ah waxaana lagu sameeyay hal-dhinac ANOVA iyadoo la adeegsanayo baaritaanka Bonferroni kadib hoc. Qiimaha p-ga ee ka yar 0.05 ayaa loo arkay mid tirakoob ahaan muhiim ah. Xogta waxaa loo soo bandhigay celcelis ahaan ± SD, tirada tijaabooyinkana waxaa lagu muujiyay jaantus kasta. Dhammaan falanqaynta iyo garaafyada waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka tirakoobka GraphPad Prism 8 ee Windows (GraphPad Software Inc., nooca 8.4.3, San Diego, USA).
Marka hore, waxaan baarnay xiriirka heerarka IPA ee serum-ka iyo beerka, jirka oo dhan, iyo qoraallada mitochondrial-ka. Guud ahaan muuqaalka qoraalka, hidda-wadaha ugu xooggan ee la xiriira heerarka IPA ee serum-ka wuxuu ahaa MAPKPK3 (FDR = 0.0077; protein kinase-activated protein kinase-activated protein kinase 3); muuqaalka qoraalka ee la xiriira mitochondria-ka, hidda-wadaha ugu xooggan ee la xiriira wuxuu ahaa AKT1 (FDR = 0.7621; AKT serine/threonine kinase 1) (Faylka dheeraadka ah 1 iyo faylka dheeraadka ah 2).
Kadib waxaan falanqeynay qoraallada caalamiga ah (n = 268; p < 0.01) iyo qoraallada la xiriira mitochondria (n = 119; p < 0.05), ugu dambeyntiina waxaan aqoonsannay apoptosis inay tahay waddada ugu muhiimsan ee canonical (p = 0.0089). Qoraallada mitochondrial ee la xiriira heerarka IPA ee serumka, waxaan diiradda saarnay apoptosis (FDR = 0.00001), mitophagy (FDR = 0.00029), iyo waddooyinka calaamadaynta TNF (FDR = 0.000006) (Jaantuska 1A, Shaxda 2, iyo Jaantusyada Dheeraadka ah 1A-B).
Falanqaynta is dulsaaran ee qoraallada caalamiga ah, kuwa la xiriira mitochondria, iyo methylation-ka DNA ee beerka aadanaha iyadoo lala xiriirinayo heerarka IPA ee seeramka. A waxay matalaysaa 268 qoraallo caalami ah, 119 qoraallo la xiriira mitochondria, iyo qoraallo la jaanqaada DNA-da oo loo sawiray 3092 goobood oo CpG ah oo la xiriira heerarka IPA ee seeramka (qiimaha p < 0.01 qoraallada caalamiga ah iyo DNA-da methylated, iyo qiimayaasha p < 0.05 qoraallada mitochondrial). Qoraallada ugu waaweyn ee is dulsaaran waxaa lagu muujiyay bartamaha (AKT1 iyo YKT6). B Khariidadda isdhexgalka ee 13-ka hiddo-side ee leh dhibcaha is-dhexgalka ugu sarreeya (0.900) oo leh hiddo-sideyaal kale waxaa laga dhisay 56-ka hiddo-side ee is dulsaaran (gobolka xariiqda madow) kuwaas oo si weyn ula xiriiray heerarka IPA ee seeramka iyadoo la adeegsanayo qalabka khadka tooska ah ee StringDB. Cagaar: Hiddo-sideyaasha lagu sawiray qaybta unugyada ee Gene Ontology (GO): mitochondria (GO: 0005739). AKT1 waa borotiinka leh dhibcaha ugu sarreeya (0.900) ee isdhexgalka borotiinnada kale ee ku salaysan xogta (iyadoo lagu saleynayo macdan qodista qoraalka, tijaabooyinka, kaydka xogta, iyo muujinta wadajirka ah). Qaloocyada shabakadu waxay matalaan borotiinnada, geesahana waxay matalaan isku xirka borotiinnada.
Maadaama metabolites-ka microbiota ee mindhicirka ay nidaamin karaan halabuurka epigenetic iyada oo loo marayo methylation-ka DNA [32], waxaan baarnay in heerarka IPA ee serum-ka ay la xiriiraan methylation-ka DNA-da beerka. Waxaan ogaanay in labada goobood ee methylation-ka ee ugu waaweyn ee la xiriira heerarka IPA ee serum-ka ay ku dhow yihiin gobolka 3 ee hodanka ku ah proline-serine-ka (C19orf55) iyo qoyska borotiinka shoogga kulaylka B (yar) xubin 6 (HSPB6) (Faylka dheeraadka ah ee 3). Methylation-ka DNA-da ee 4350 CpG (p < 0.01) wuxuu la xiriiray heerarka IPA ee serum-ka waxaana lagu kobciyay waddooyinka sharciyeynta cimriga dheer (p = 0.006) (Jaantuska 1A, Shaxda 2, iyo Sawirka Dheeraadka ah ee 1C).
Si aan u fahanno hababka bayoolojiga ee salka ku haya xiriirka ka dhexeeya heerarka IPA ee seeramka, qoraallada caalamiga ah, qoraallada la xiriira mitochondria, iyo methylation-ka DNA ee beerka aadanaha, waxaan sameynay falanqayn isku dhafan oo ku saabsan hidde-sideyaasha lagu aqoonsaday falanqaynta marinnada hore (Jaantuska 1A). Natiijooyinka falanqaynta kobcinta marinnada ee 56-ka hiddo-side ee is dulsaaran (gudaha xariiqda madow ee Jaantuska 1A) waxay muujiyeen in marinnada apoptosis (p = 0.00029) ay muujiyeen laba hiddo-side oo caadi u ah saddexda falanqayn: AKT1 iyo YKT6 (YKT6 v-SNARE homolog), sida lagu muujiyey jaantuska Venn (Jaantuska Dheeraadka ah 2 iyo Jaantuska 1A). Waxaa xiiso leh, waxaan ogaanay in AKT1 (cg19831386) iyo YKT6 (cg24161647) ay si togan ula xiriireen heerarka IPA ee seeramka (Faylka Dheeraadka ah 3). Si loo aqoonsado isdhexgalka borotiinka ee suurtagalka ah ee u dhexeeya alaabada hidda-wadaha, waxaan doorannay 13 hiddo-side oo leh dhibcaha gobolka ugu sarreeya (0.900) oo ka mid ah 56 hiddo-side oo is dulsaaran sida gelinta waxaanan dhisnay khariidad is-dhexgal. Sida laga soo xigtay heerka kalsoonida (kalsoonida xadka), hidda-wadaha AKT1 ee dhibcaha ugu sarreeya (0.900) ayaa ugu sarreeyay (Jaantuska 1B).
Iyada oo lagu saleynayo falanqaynta marinnada, waxaan ogaanay in apoptosis uu ahaa waddada ugu weyn, sidaa darteed waxaan baarnay in daaweynta IPA ay saameyn doonto apoptosis-ka HSCs in vitro. Waxaan hore u muujinnay in qiyaaso kala duwan oo IPA ah (10 μM, 100 μM, iyo 1 mM) aysan sun ku ahayn unugyada LX-2 [15]. Daraasaddani waxay muujisay in daaweynta IPA ee 10 μM iyo 100 μM ay kordhisay tirada unugyada nool iyo kuwa necrotic-ga ah. Si kastaba ha ahaatee, marka la barbardhigo kooxda xakamaynta, noolaanshaha unugyadu wuxuu hoos u dhacay 1 mM IPA fiirsashada, halka heerka necrosis-ka unugyadu uusan isbeddelin (Jaantuska 2A, B). Marka xigta, si loo helo isku-darka ugu habboon ee lagu kicin karo apoptosis-ka unugyada LX-2, waxaan tijaabinay 10 μM, 100 μM, iyo 1 mM IPA muddo 24 saacadood ah (Jaantuska 2A-E iyo Sawirka Dheeraadka ah 3A-B). Waxaa xiiso leh, IPA 10 μM iyo 100 μM waxay hoos u dhigeen heerka apoptosis (%), si kastaba ha ahaatee, IPA 1 mM waxay kordhisay heerka apoptosis dambe iyo apoptosis (%) marka la barbar dhigo kantaroolka sidaas darteedna waxaa loo doortay tijaabooyin dheeraad ah (Jaantusyada 2A–D).
IPA waxay kicisaa apoptosis-ka unugyada LX-2. Habka rinjiyeynta laba-laaban ee Annexin V iyo 7-AAD ayaa loo isticmaalay in lagu cabbiro heerka apoptotic-ga iyo qaab-dhismeedka unugyada iyadoo la adeegsanayo cytometry socodka. Unugyada BA waxaa lagu kululeeyay 10 μM, 100 μM iyo 1 mM IPA muddo 24 saacadood ah ama iyadoo la adeegsanayo F–H TGF-β1 (5 ng/ml) iyo 1 mM IPA oo ah dhexdhexaad aan seeram lahayn muddo 24 saacadood ah. A: unugyada nool (Annexin V -/ 7AAD-); B: unugyada necrotic-ga (Annexin V -/ 7AAD+); C, F: hore (Annexin V +/ 7AAD-); D, G: dambe (Annexin V+/7AAD.+); E, H: boqolkiiba wadarta unugyada apoptotic-ga hore iyo kuwa dambe ee heerka apoptotic-ga (%). Xogta waxaa lagu muujiyay celcelis ahaan ± SD, n = 3 tijaabo oo madax-bannaan. Isbarbardhigga tirakoobka waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo hal-dhinac ANOVA oo leh imtixaanka Bonferroni kadib hoc. *p < 0.05; ****p < 0.0001
Sida aan hore u tusnay, 5 ng/ml TGF-β1 waxay kicin kartaa firfircoonida HSC iyadoo kordhinaysa muujinta hiddo-wadaha calaamadeysan ee caadiga ah [15]. Unugyada LX-2 waxaa lagu daaweeyay 5 ng/ml TGF-β1 iyo 1 mM IPA oo isku dhafan (Jaantuska 2E-H). Daaweynta TGF-β1 ma aysan beddelin heerka apoptosis, si kastaba ha ahaatee, daaweynta wadajirka ah ee IPA waxay kordhisay heerka apoptosis dambe iyo apoptosis (%) marka la barbar dhigo daaweynta TGF-β1 (Jaantuska 2E-H). Natiijooyinkani waxay muujinayaan in 1 mM IPA ay kor u qaadi karto apoptosis unugyada LX-2 si madax-bannaan oo aan ahayn kicinta TGF-β1.
Waxaan si dheeraad ah u baarnay saameynta IPA ku leedahay neefsashada mitochondrial ee unugyada LX-2. Natiijooyinka waxay muujiyeen in 1 mM IPA ay hoos u dhigtay xuduudaha heerka isticmaalka oksijiinta (OCR): neefsashada aan mitochondrial ahayn, neefsashada basal iyo tan ugu badan, daadinta proton iyo wax soo saarka ATP marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta (Jaantuska 3A, B), halka tusmada caafimaadka bioenergetic (BHI) aysan isbeddelin.
IPA waxay yareysaa neefsashada mitochondrial ee unugyada LX-2. Qalooca neefsashada mitochondrial (OCR) waxaa loo soo bandhigay sida xuduudaha neefsashada mitochondrial (neefsashada aan mitochondrial ahayn, neefsashada asalka ah, neefsashada ugu badan, daadinta proton, jiilka ATP, SRC iyo BHI). Unugyada A iyo B waxaa lagu kululeeyay 10 μM, 100 μM iyo 1 mM IPA muddo 24 saacadood ah, siday u kala horreeyaan. Unugyada C iyo D waxaa lagu kululeeyay TGF-β1 (5 ng/ml) iyo 1 mM IPA oo ku jira dhexdhexaad aan seeram lahayn muddo 24 saacadood ah, siday u kala horreeyaan. Dhammaan cabbiraadaha waxaa loo caadiyeeyay heerka DNA iyadoo la adeegsanayo qalabka CyQuant. BHI: tusmada caafimaadka bioenergetic; SRC: awoodda kaydka neefsashada; OCR: heerka isticmaalka oksijiinta. Xogta waxaa loo soo bandhigay celcelis ahaan ± heerka isbeddelka caadiga ah (SD), n = 5 tijaabo oo madax-bannaan. Isbarbardhigga tirakoobka waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo hal-dhinac ANOVA iyo Bonferroni kadib baaritaanka hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; iyo ***p < 0.001
Si aan u helno faham dhammaystiran oo ku saabsan saameynta IPA ee ku leedahay astaamaha bayoolojiga ee unugyada LX-2 ee firfircoon ee TGF-β1, waxaan falanqaynay fosfooraska oksaydhka ee mitochondrial by OCR (Jaantuska 3C,D). Natiijooyinka waxay muujiyeen in daaweynta TGF-β1 ay yareyn karto neefsashada ugu badan, awoodda kaydka neefsashada (SRC) iyo BHI marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta (Jaantuska 3C,D). Intaa waxaa dheer, daaweynta isku dhafan waxay yareysay neefsashada aasaasiga ah, daadinta proton iyo wax soo saarka ATP, laakiin SRC iyo BHI waxay si weyn uga sarreeyeen kuwa lagu daaweeyay TGF-β1 (Jaantuska 3C,D).
Waxaan sidoo kale sameynay "Tijaabada Fenotype-ka Tamarta Unugyada" oo ay bixisay barnaamijka Seahorse (Sawirka Dheeraadka ah ee 4A–D). Sida lagu muujiyey Sawirka Dheeraadka ah ee 3B, labada awoodood ee dheef-shiid kiimikaadka OCR iyo ECAR ayaa hoos u dhacay ka dib daaweynta TGF-β1, si kastaba ha ahaatee, ma jirin wax farqi ah oo lagu arkay isku-darka iyo kooxaha daaweynta IPA marka loo eego kooxda xakamaynta. Intaa waxaa dheer, heerarka aasaasiga ah iyo cadaadiska labadaba ee OCR ayaa hoos u dhacay ka dib isku-darka iyo daaweynta IPA marka loo eego kooxda xakamaynta (Sawirka Dheeraadka ah ee 4C). Waxaa xiiso leh, qaab la mid ah ayaa lagu arkay daaweynta isku-darka, halkaas oo aan wax isbeddel ah lagu arag heerarka aasaasiga ah iyo cadaadiska ee ECAR marka loo eego daaweynta TGF-β1 (Sawirka Dheeraadka ah ee 4C). HSC-yada, hoos u dhaca fosfooraska oksaydhka mitochondrial iyo awoodda daaweynta isku-darka si loo soo celiyo SCR iyo BHI ka dib soo-gaadhista daaweynta TGF-β1 ma beddelin awoodda dheef-shiid kiimikaadka (OCR iyo ECAR). Marka la isku soo wada duubo, natiijooyinkani waxay muujinayaan in IPA ay yareyn karto tamarta bayoolojiga ee HSCs, taasoo soo jeedinaysa in IPA ay kicin karto muuqaal tamar hooseeya oo u beddelaya dabeecadda HSC dhinaca joojinta (Jaantuska Dheeraadka ah 4D).
Saamaynta IPA ee dhaqdhaqaaqa mitochondrial-ka ayaa la baaray iyadoo la adeegsanayo cabbir saddex-cabbir ah oo qaab-dhismeedka mitochondrial iyo isku xirka shabakada iyo sidoo kale rinjiyeynta MTR (Jaantuska 4 iyo Sawirka Dheeraadka ah ee 5). Jaantuska 4 wuxuu muujinayaa, marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta, daaweynta TGF-β1 waxay yareysay celceliska dusha sare, tirada laanta, dhererka laanta guud, iyo tirada isku xirka laanta (Jaantuska 4A iyo B) waxayna beddeshay saamiga mitochondria laga bilaabo qaab-dhismeedka wareegsan ilaa dhexdhexaadka ah (Jaantuska 4C). Daaweynta IPA oo keliya ayaa yareysay celceliska mugga mitochondrial waxayna beddeshay saamiga mitochondria laga bilaabo qaab-dhismeedka wareegsan ilaa dhexdhexaadka ah marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta (Jaantuska 4A). Taas bedelkeeda, booska, celceliska dhererka laanta, iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial oo lagu qiimeeyay MTR-ka ku tiirsan xuubka mitochondrial-ka ee suurtagalka ah (Jaantuska 4A iyo E) ayaa weli isbeddelin xuduudahanina ma aysan kala duwanayn kooxaha. Marka la isku daro, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in daaweynta TGF-β1 iyo IPA ay u muuqdaan inay wax ka beddelaan qaabka iyo cabbirka mitochondrial iyo sidoo kale kakanaanta shabakadda ee unugyada nool ee LX-2.
IPA waxay beddeshaa dhaqdhaqaaqa mitochondrial iyo tirada DNA-da mitochondrial ee unugyada LX-2. A. Sawirrada isku-dhafka ah ee matalaya unugyada LX-2 ee nool ee lagu dahaadhay TGF-β1 (5 ng/ml) iyo 1 mM IPA muddo 24 saacadood ah oo ku jira dhexdhexaad aan seeram lahayn oo muujinaya shabakadaha mitochondrial oo lagu dahaadhay Mitotracker™ Red CMXRos iyo buluug nuclei ah oo lagu dahaadhay DAPI. Dhammaan xogta waxay ka koobnayd ugu yaraan 15 sawir koox kasta. Waxaan helnay 10 sawir oo Z-stack ah nooc kasta oo muunad ah. Taxane kasta oo Z-dhidib ah wuxuu ka koobnaa 30 xaleef, mid walbana dhumucdiisu waa 9.86 μm. Barka miisaanka: 10 μm. B. Walxaha matalaya (mitochondria oo keliya) oo lagu aqoonsaday iyadoo la adeegsanayo marin-habaabinta la qabsiga sawirka. Falanqaynta tirada iyo isbarbardhigga isku xirka shabakadda qaab-dhismeedka mitochondrial ayaa loo sameeyay dhammaan unugyada koox kasta. C. Soo noqnoqoshada saamiga qaabka mitochondrial. Qiimaha u dhow 0 wuxuu tilmaamayaa qaabab wareegsan, qiimayaasha u dhow 1 waxay muujinayaan qaabab fiilooyin ah. D Mitochondrial DNA (mtDNA) waxaa lagu go'aamiyay sida lagu sharaxay Agabka iyo Hababka. Falanqaynta E Mitotracker™ Red CMXRos waxaa lagu sameeyay cytometry socodka (30,000 oo dhacdo) sida lagu sharaxay Agabka iyo Hababka. Xogta waxaa loo soo bandhigay celcelis ahaan ± SD, n = 3 tijaabo oo madax-bannaan. Isbarbardhigga tirakoobka waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo hal-dhinac ANOVA iyo Bonferroni kadib tijaabada hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Kadib waxaan falanqeynay maadada mtDNA ee unugyada LX-2 iyadoo ah tilmaame tirada mitochondrial. Marka la barbardhigo kooxda xakamaynta, maadada mtDNA waxaa lagu kordhiyay kooxda lagu daweeyay TGF-β1 (Jaantuska 4D). Marka la barbardhigo kooxda lagu daweeyay TGF-β1, maadada mtDNA ayaa hoos u dhacday kooxda daaweynta isku dhafan (Jaantuska 4D), taasoo soo jeedinaysa in IPA ay yareyn karto maadada mtDNA iyo suurtogalnimada tirada mitochondrial iyo sidoo kale neefsashada mitochondrial (Jaantuska 3C). Intaa waxaa dheer, IPA waxay u muuqatay inay yareyso maadada mtDNA ee daaweynta isku dhafan laakiin ma saameynin dhaqdhaqaaqa mitochondrial-ka ee MTR dhexdhexaadiyo (Jaantusyada 4A-C).
Waxaan baarnay xiriirka IPA iyo heerarka mRNA ee hiddo-sideyaasha la xiriira fibrosis, apoptosis, badbaadada, iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee unugyada LX-2 (Jaantuska 5A–D). Marka la barbardhigo kooxda xakamaynta, kooxda lagu daweeyay TGF-β1 waxay muujiyeen muujinta kordhaysa ee hiddo-sideyaasha sida silsiladda kolajka nooca I α2 (COL1A2), actin muruqa α-smooth (αSMA), matrix metalloproteinase 2 (MMP2), unugyada joojiya metalloproteinase 1 (TIMP1), iyo hiddo-side dynamin 1-like (DRP1), taasoo muujinaysa koror fibrosis iyo firfircooni. Intaa waxaa dheer, marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta, daaweynta TGF-β1 waxay hoos u dhigtay heerarka mRNA ee soo-dhoweeyaha uurka nukliyeerka X (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKPK3, oo joojiya B-unugga α, kor u qaada peptide-ka iftiinka hiddo-side ee factor κ (NFκB1A), iyo ka hortagga factor κB kinase subunit β (IKBKB) (Jaantuska 5A–D). Marka la barbardhigo daaweynta TGF-β1, daaweynta isku dhafan ee TGF-β1 iyo IPA waxay yareysay muujinta COL1A2 iyo MMP2, laakiin waxay kordhisay heerarka mRNA ee PXR, TIMP1, B-cell lymphoma-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β, iyo IKBKB. Daaweynta IPA waxay si weyn hoos ugu dhigtay muujinta MMP2, borotiinka la xiriira Bcl-2 X (BAX), AKT1, borotiinka atrophy optic 1 (OPA1), iyo borotiinka isku-darka mitochondrial 2 (MFN2), halka muujinta CASP8, NFκB1A, NFκB1B, iyo IKBKB la kordhiyay marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta. Si kastaba ha ahaatee, wax farqi ah lagama helin muujinta caspase-3 (CASP3), apoptotic peptidase activating factor 1 (APAF1), mitochondrial fusion protein 1 (MFN1), iyo borotiinka fission 1 (FIS1). Guud ahaan, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in daaweynta IPA ay wax ka beddesho muujinta hidda-wadaha la xiriira fibrosis, apoptosis, badbaadada, iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial. Xogtayadu waxay soo jeedinaysaa in daaweynta IPA ay yareyso fibrosis-ka unugyada LX-2; isla markaana, waxay kicisaa badbaadada iyadoo u wareejinaysa nooca 'phenotype' dhinaca joojinta.
IPA waxay wax ka beddeshaa muujinta hiddo-sidayaasha firfircoonida fibroblast, apoptotic, noolaanshaha, iyo mitochondrial ee unugyada LX-2. Histograms-ku waxay muujiyaan muujinta mRNA marka loo eego xakamaynta endogenous (RPLP0 ama PPIA) ka dib markii unugyada LX-2 lagu kiciyay TGF-β1 iyo IPA oo ku jira dhexdhexaad aan seeram lahayn muddo 24 saacadood ah. A waxay tilmaamaysaa fibroblasts, B waxay tilmaamaysaa unugyada apoptotic, C waxay tilmaamaysaa unugyada badbaaday, D-na waxay muujinaysaa muujinta hidda-wadaha firfircoonida mitochondrial. Xogta waxaa loo soo bandhigay celcelis ahaan ± leexashada caadiga ah (SD), n = 3 tijaabo oo madax-bannaan. Isbarbardhigga tirakoobka waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo hal-dhinac ANOVA iyo Bonferroni kadib baaritaanka hoc. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001
Kadib, isbeddellada cabbirka unugyada (FSC-H) iyo kakanaanta cytoplasmic (SSC-H) waxaa lagu qiimeeyay cytometry socodka (Jaantuska 6A,B), isbeddellada qaab-dhismeedka unugyada ka dib daaweynta IPA waxaa lagu qiimeeyay mikroskoobka elektaroonigga gudbinta (TEM) iyo mikroskoobka isbarbardhigga marxaladda (Jaantuska Dheeraadka ah 6A-B). Sida la filayay, unugyada kooxda lagu daweeyay TGF-β1 ayaa kordhay cabbirka marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta (Jaantuska 6A,B), taasoo muujinaysa ballaarinta caadiga ah ee reticulum-ka qallafsan ee endoplasmic (ER*) iyo phagolysosomes (P), taasoo muujinaysa kicinta unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSC) (Jaantuska Dheeraadka ah 6A). Si kastaba ha ahaatee, marka la barbardhigo kooxda lagu daweeyay TGF-β1, cabbirka unugyada, kakanaanta cytoplasmic (Jaantuska 6A,B), iyo waxyaabaha ku jira ER* ayaa hoos u dhacay kooxda daaweynta isku-dhafka ah ee TGF-β1 iyo IPA (Jaantuska Dheeraadka ah 6A). Intaa waxaa dheer, daaweynta IPA waxay hoos u dhigtay cabbirka unugyada, kakanaanta cytoplasmic (Jaantusyada 6A,B), P iyo ER* (Jaantuska Dheeraadka ah ee 6A) marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta. Intaa waxaa dheer, nuxurka unugyada apoptotic ayaa kordhay ka dib 24 saacadood oo daaweynta IPA ah marka la barbar dhigo kooxda xakamaynta (fallaadho cad, Jaantuska Dheeraadka ah ee 6B). Guud ahaan, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in 1 mM IPA ay kicin karto apoptosis HSC oo ay dib u celin karto isbeddellada ku yimaada xuduudaha qaab-dhismeedka unugyada ee ay keento TGF-β1, taasoo nidaaminaysa cabbirka iyo kakanaanta unugyada, taas oo lala xiriirin karo joojinta HSC.
IPA waxay beddeshaa cabbirka unugyada iyo kakanaanta cytoplasmic ee unugyada LX-2. Sawirro matalaya falanqaynta cytometry socodka. Falanqaynta waxay isticmaashay istaraatiijiyad goynta oo gaar u ah unugyada LX-2: SSC-A/FSC-A si loo qeexo tirada unugyada, FSC-H/FSC-A si loo aqoonsado labalaabyada, iyo SSC-H/FSC-H si loo falanqeeyo cabbirka unugyada iyo kakanaanta. Unugyada waxaa lagu dhex geliyay TGF-β1 (5 ng/ml) iyo 1 mM IPA oo ku jira dhexdhexaad aan seeram lahayn muddo 24 saacadood ah. Unugyada LX-2 waxaa loo qaybiyay rubuc bidix hoose (SSC-H-/FSC-H-), rubuc bidix sare (SSC-H+/FSC-H-), rubuc midig hoose (SSC-H-/FSC-H+), iyo rubuc midig sare (SSC-H+/FSC-H+) si loo helo falanqaynta cabbirka unugyada iyo kakanaanta cytoplasmic. B. Qaab-dhismeedka unugyada waxaa lagu falanqeeyay cytometry socodka iyadoo la adeegsanayo FSC-H (fidinta hore, cabbirka unugyada) iyo SSC-H (fidinta dhinaca, isku-dhafka cytoplasmic) (30,000 oo dhacdo). Xogta waxaa loo soo bandhigay celcelis ahaan ± SD, n = 3 tijaabo oo madax-bannaan. Isbarbardhigga tirakoobka waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo hal-dhinac ANOVA iyo Bonferroni imtixaanka hoc kadib. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001 iyo ****p < 0.0001
Dheef-shiid kiimikaadka mindhicirka sida IPA ayaa noqday mowduuc aad loo xiiseeyo oo cilmi-baaris ah, taasoo soo jeedinaysa in bartilmaameedyo cusub laga heli karo microbiota mindhicirka. Sidaa darteed, waa wax xiiso leh in IPA, oo ah metabolite aan ku xirnay fibrosis beerka ee aadanaha [15], la muujiyay inay tahay isku-darka ka hortagga fibrosis-ka ee moodooyinka xayawaanka [13, 14]. Halkan, waxaan markii ugu horreysay ku muujineynaa xiriir ka dhexeeya IPA serum iyo transcriptionomics-ka beerka adduunka iyo methylation-ka DNA ee shakhsiyaadka cayilan ee aan lahayn nooca 2aad ee sonkorowga (T2D), taasoo muujinaysa apoptosis, mitophagy iyo cimri dherer, iyo sidoo kale hidde-side suurtagal ah oo AKT1 ah oo nidaaminaya homeostasis-ka beerka. Wax cusub oo ka mid ah daraasaddeenna ayaa ah inaan muujinnay isdhexgalka daaweynta IPA ee apoptosis, qaab-dhismeedka unugyada, bioenergetics-ka mitochondrial iyo dhaqdhaqaaqa unugyada LX-2, taasoo muujinaysa spectrum tamar hooseeya oo u beddelaya phenotype-ka HSC dhinaca joojinta, taasoo ka dhigaysa IPA musharax suurtagal ah oo lagu hagaajinayo fibrosis-ka beerka.
Waxaan ogaanay in apoptosis, mitophagy iyo cimri dhererku ay ahaayeen waddooyinka ugu muhiimsan ee canonical-ka ah ee lagu kobciyo hiddo-sidayaasha beerka ee la xiriira wareegga IPA ee serum-ka. Khalkhalka nidaamka xakamaynta tayada mitochondrial (MQC) wuxuu horseedi karaa cillad mitochondrial, mitophagy iyo apoptosis, taasoo kor u qaadaysa dhacdada MASLD [33, 34]. Sidaa darteed, waxaan qiyaasi karnaa in IPA ay ku lug yeelan karto ilaalinta dhaqdhaqaaqa unugyada iyo sharafta mitochondrial iyada oo loo marayo apoptosis, mitophagy iyo cimri dhererka beerka. Xogtayadu waxay muujisay in laba hiddo-side ay caadi ahaayeen saddexda baaritaan: YKT6 iyo AKT1. Waxaa xusid mudan in YKT6 uu yahay borotiin SNARE ah oo ku lug leh geeddi-socodka isku-dhafka xuubka unugyada. Waxay door ka ciyaartaa autophagy iyo mitophagy iyadoo sameysanaysa isku-dhafan bilow ah oo leh STX17 iyo SNAP29 oo ku saabsan autophagosome, taasoo kor u qaadaysa isku-darka autophagosomes iyo lysosomes [35]. Intaa waxaa dheer, luminta shaqada YKT6 waxay keentaa cillad ku timaadda mitophagy [36], halka kor u qaadista YKT6 ay la xiriirto horumarka kansarka beerka ee hepatocellular carcinoma (HCC), taasoo muujinaysa kororka badbaadada unugyada [37]. Dhanka kale, AKT1 waa hidda-wadaha ugu muhiimsan ee is-dhexgalka waxayna door muhiim ah ka ciyaartaa cudurrada beerka, oo ay ku jiraan marinnada calaamadaynta PI3K/AKT, wareegga unugyada, socdaalka unugyada, kororka, isku-xidhka diiradda, shaqada mitochondrial, iyo dheecaanka kolajka [38-40]. Waddada calaamadaynta PI3K/AKT ee firfircoon waxay kicin kartaa unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSCs), kuwaas oo ah unugyada mas'uulka ka ah soo saarista matrix-ka ka baxsan jirka (ECM), nidaaminteeduna waxay gacan ka geysan kartaa dhacdada iyo horumarka fibrosis-ka beerka [40]. Intaa waxaa dheer, AKT waa mid ka mid ah arrimaha badbaadada unugyada muhiimka ah ee joojiya apoptosis-ka unugyada ku tiirsan p53, dhaqdhaqaaqa AKT waxaa laga yaabaa inuu la xiriiro joojinta apoptosis-ka unugyada beerka [41, 42]. Natiijooyinka la helay waxay soo jeedinayaan in IPA ay ku lug yeelan karto apoptosis-ka la xiriira mitochondria-ka beerka iyadoo saameyn ku yeelanaysa go'aanka hepatocytes-ka inta u dhaxaysa gelitaanka apoptosis ama badbaadada. Saamayntan waxaa nidaamin kara hiddo-wadaha musharraxa AKT iyo/ama YKT6, kuwaas oo muhiim u ah homeostasis-ka beerka.
Natiijooyinkayagu waxay muujiyeen in 1 mM IPA ay kicisay apoptosis iyo hoos u dhaca neefsashada mitochondrial ee unugyada LX-2 oo ka madax bannaan daaweynta TGF-β1. Waxaa xusid mudan in apoptosis ay tahay waddo weyn oo loogu talagalay xallinta fibrosis iyo kicinta unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSC), waana dhacdo muhiim ah oo ku jirta jawaabta jir ahaaneed ee la beddeli karo ee fibrosis-ka beerka [4, 43]. Intaa waxaa dheer, soo celinta BHI ee unugyada LX-2 ka dib daaweynta isku dhafan waxay bixisay aragtiyo cusub oo ku saabsan doorka suurtagalka ah ee IPA ee nidaaminta bioenergetics-ka mitochondrial. Xaaladaha nasashada iyo kuwa aan firfircoonayn, unugyada hematopoietic waxay caadi ahaan isticmaalaan fosfooraska oksaydhka mitochondrial si ay u soo saaraan ATP waxayna leeyihiin dhaqdhaqaaq dheef-shiid kiimikaad hooseeya. Dhanka kale, kicinta HSC waxay kor u qaaddaa neefsashada mitochondrial iyo bayosynthesis si ay u magdhabaan baahiyaha tamarta ee gelitaanka xaaladda glycolytic [44]. Xaqiiqda ah in IPA aysan saameyn ku yeelan awoodda dheef-shiid kiimikaadka iyo ECAR waxay soo jeedinaysaa in waddada glycolytic aan la mudnayn. Sidoo kale, daraasad kale ayaa muujisay in 1 mM IPA ay awood u yeelatay inay wax ka beddesho dhaqdhaqaaqa silsiladda neefsashada ee mitochondrial ee unugyada wadnaha, unugyada hepatocyte-ka aadanaha (Huh7) iyo unugyada endothelial-ka xididka xudunta aadanaha (HUVEC); Si kastaba ha ahaatee, wax saameyn ah oo IPA ah lagama helin glycolysis-ka ee unugyada wadnaha, taasoo soo jeedinaysa in IPA ay saameyn karto bayoolajiyada noocyada kale ee unugyada [45]. Sidaa darteed, waxaan qiyaaseynaa in 1 mM IPA ay u dhaqmi karto sidii isku xidhka kiimikada oo khafiif ah, maadaama ay si weyn u yareyn karto muujinta hidda-wadaha fibrogenic, qaab-dhismeedka unugyada iyo bayoolajiyada mitochondrial iyada oo aan la beddelin xaddiga mtDNA [46]. Kala-goysyada Mitochondrial waxay joojin karaan fibrosis-ka dhaqanka iyo kicinta HSC [47] waxayna yareyn karaan wax soo saarka ATP-ga mitochondrial ee ay xakameeyaan ama ay kiciyaan borotiinno gaar ah sida borotiinnada kala-goysyada (UCP) ama adenine nucleotide translocase (ANT). Iyada oo ku xidhan nooca unugyada, dhacdadani waxay ka ilaalin kartaa unugyada apoptosis iyo/ama kor u qaadi kartaa apoptosis [46]. Si kastaba ha ahaatee, daraasado dheeraad ah ayaa loo baahan yahay si loo caddeeyo doorka IPA oo ah isku xidhka mitochondrial ee joojinta unugyada asliga ah ee hematopoietic.
Kadib waxaan baarnay in isbeddellada ku yimaada neefsashada mitochondrial ay ka muuqdaan qaab-dhismeedka mitochondrial ee unugyada nool ee LX-2. Waxaa xiiso leh, daaweynta TGF-β1 waxay beddeshaa saamiga mitochondrial laga bilaabo wareegsan ilaa dhexdhexaad, iyadoo la yareynayo laanta mitochondrial iyo muujinta kordhaysa ee DRP1, oo ah qodob muhiim ah oo ku jira kala-goynta mitochondrial [48]. Intaa waxaa dheer, kala-goynta mitochondrial waxay la xiriirtaa isku-dhafka shabakadda guud, kala-guurka ka imanaya isku-dhafka ilaa kala-goynta ayaa muhiim u ah kicinta unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSC), halka joojinta kala-goynta mitochondrial ay horseeddo apoptosis HSC [49]. Sidaa darteed, natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in daaweynta TGF-β1 ay sababi karto hoos u dhac ku yimaada isku-dhafka shabakadda mitochondrial iyadoo la dhimayo laanta, taas oo aad ugu badan kala-goynta mitochondrial ee la xiriirta unugyada asliga ah ee hematopoietic ee firfircoon (HSCs). Intaa waxaa dheer, xogteennu waxay muujisay in IPA ay beddeli karto saamiga mitochondria laga bilaabo qaab wareegsan ilaa dhexdhexaad, taasoo yareynaysa muujinta OPA1 iyo MFN2. Daraasaduhu waxay muujiyeen in hoos u dhaca OPA1 uu sababi karo hoos u dhac ku yimaada awoodda xuubka mitochondrial iyo kicinta apoptosis-ka unugyada [50]. MFN2 waxaa loo yaqaanaa inay dhexdhexaadiso isku-darka mitochondrial iyo apoptosis [51]. Natiijooyinka la helay waxay soo jeedinayaan in kicinta unugyada LX-2 ee TGF-β1 iyo/ama IPA ay u muuqato inay wax ka beddesho qaabka iyo cabbirka mitochondrial, iyo sidoo kale xaaladda kicinta iyo kakanaanta shabakadda.
Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in daaweynta isku-dhafka ah ee TGFβ-1 iyo IPA ay yareyn karto mtDNA iyo xuduudaha qaab-dhismeedka unugyada iyadoo la nidaaminayo muujinta mRNA ee fibrosis, apoptosis iyo hiddo-wadaha la xiriira badbaadada ee unugyada ka baxsanaya apoptosis. Runtii, IPA waxay hoos u dhigtay heerka muujinta mRNA ee AKT1 iyo hiddo-wadaha fibrosis ee muhiimka ah sida COL1A2 iyo MMP2, laakiin waxay kordhisay heerka muujinta CASP8, kaas oo lala xiriiriyo apoptosis. Natiijooyinkayagu waxay muujiyeen in ka dib daaweynta IPA, muujinta BAX ay hoos u dhacday iyo muujinta mRNA ee qaybaha hoose ee qoyska TIMP1, BCL-2 iyo NF-κB ay korodhay, taasoo soo jeedinaysa in IPA ay kicin karto calaamadaha badbaadada ee unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSCs) kuwaas oo ka baxsada apoptosis. Molecules-kani waxay u dhaqmi karaan sidii calaamado badbaado oo ku jira unugyada asliga ah ee hematopoietic ee firfircoon, kuwaas oo lala xiriirin karo muujinta kordhaysa ee borotiinnada ka hortagga apoptosis (sida Bcl-2), muujinta oo yaraatay ee BAX pro-apoptotic, iyo is-dhexgal adag oo u dhexeeya TIMP iyo NF-κB [5, 7]. IPA waxay saameynteeda ku samaysaa PXR, waxaana ogaanay in daaweynta isku dhafan ee TGF-β1 iyo IPA ay kordhisay heerarka muujinta mRNA ee PXR, taasoo muujinaysa xakamaynta kicinta HSC. Calaamadaynta PXR ee firfircoon ayaa la ogyahay inay joojiso kicinta HSC labadaba gudaha iyo gudaha [52, 53]. Natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in IPA ay ka qayb qaadan karto nadiifinta HSC-yada firfircoon iyadoo kor u qaadaysa apoptosis, yaraynta fibrosis iyo dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial, iyo kor u qaadida calaamadaha badbaadada, kuwaas oo ah habab caadi ah oo u beddela phenotype-ka firfircoon ee HSC mid aan firfircoonayn. Sharaxaad kale oo suurtagal ah oo ku saabsan habka iyo doorka IPA ee apoptosis waa inay si toos ah u nadiifiso mitochondria-ka aan shaqaynayn iyada oo loo marayo mitophagy (marinka gudaha) iyo marinka calaamadaynta TNF ee dibadda (Jadwalka 1), kaas oo si toos ah ugu xiran marinka calaamadaynta badbaadada NF-κB (Jaantuska Dheeraadka ah 7). Waxaa xiiso leh, hiddo-sidayaasha la kobciyay ee la xiriira IPA waxay awoodaan inay kiciyaan calaamadaha pro-apoptotic iyo pro-survival ee marin-haweedka apoptotic [54], taasoo soo jeedinaysa in IPA ay kicin karto marin-haweedka apoptotic ama badbaadada iyadoo la falgalaysa hiddo-sidayaashan. Si kastaba ha ahaatee, sida IPA u kiciso apoptosis ama badbaado inta lagu jiro firfircoonida HSC iyo waddooyinkeeda farsamada weli ma cadda.
IPA waa metabolite microbial ah oo laga sameeyay tryptophan-ka cuntada iyada oo loo marayo microbiota mindhicirka. Daraasaduhu waxay muujiyeen inay leedahay sifooyin nidaamin ka-hortagga bararka, antioxidant-ka, iyo epigenetic ee deegaanka mindhicirka.[55] Daraasaduhu waxay muujiyeen in IPA ay wax ka beddeli karto shaqada xannibaadda mindhicirka oo ay yareyn karto walbahaarka oksaydhka, taas oo gacan ka geysan karta saameynteeda jireed ee maxalliga ah.[56] Xaqiiqdii, IPA waxaa loo qaadaa xubnaha bartilmaameedka iyada oo loo marayo wareegga dhiigga, maadaama IPA ay la wadaagto qaab-dhismeed metabolite weyn oo la mid ah tryptophan, serotonin, iyo derivatives indole, IPA waxay samaysaa ficillo dheef-shiid kiimikaad oo keenaya qaddarro dheef-shiid kiimikaad oo tartan ah.[52] IPA waxay la tartami kartaa metabolites-ka laga soo qaatay tryptophan si loogu xidho goobaha ku xiran ensaymyada ama qaataha, taasoo laga yaabo inay carqaladeyso waddooyinka dheef-shiid kiimikaadka caadiga ah. Tani waxay iftiimineysaa baahida loo qabo daraasado dheeraad ah oo ku saabsan farmashiyo-yaqaannada iyo farmashiyooyinka si loo fahmo daaqaddeeda daaweynta.[57] Wali waa la arki doonaa in tani ay sidoo kale ka dhici karto unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSCs).
Waxaan qireynaa in daraasaddeennu ay leedahay xaddidaadyo. Si gaar ah loo baaro xiriirka la xiriira IPA, waxaan ka saarnay bukaanada qaba nooca 2aad ee sonkorowga mellitus (T2DM). Waxaan qireynaa in tani ay xaddidayso ku habboonaanta ballaaran ee natiijooyinkayaga bukaanada qaba nooca 2aad ee sonkorowga mellitus iyo cudurka beerka ee horumarsan. Inkasta oo fiirsashada jirka ee IPA ee seeramka aadanaha ay tahay 1-10 μM [11, 20], fiirsashada 1 mM IPA ayaa la doortay iyadoo lagu saleynayo fiirsashada ugu sarreysa ee aan sunta ahayn [15] iyo heerka ugu sarreeya ee apoptosis, iyada oo aan jirin wax farqi ah oo ku jira boqolleyda tirada unugyada necrotic. In kasta oo heerarka sare ee IPA loo isticmaalay daraasaddan, haddana ma jiro wax isku raacsan oo ku saabsan qiyaasta waxtarka leh ee IPA [52]. In kasta oo natiijooyinkeennu ay muhiim yihiin, qaddarka dheef-shiid kiimikaadka ballaaran ee IPA ayaa weli ah goob firfircoon oo cilmi-baaris ah. Intaa waxaa dheer, natiijooyinkayaga ku saabsan xiriirka ka dhexeeya heerarka IPA ee seeramka iyo methylation-ka DNA-da ee qoraallada beerka waxaa laga helay oo keliya unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSCs) laakiin sidoo kale unugyada beerka. Waxaan doorannay inaan isticmaalno unugyada LX-2 ee aadanaha iyadoo lagu saleynayo natiijooyinkii hore ee ka soo baxay falanqaynta qoraalka ah ee sheegaya in IPA ay la xiriirto kicinta unugyada asliga ah ee hematopoietic (HSC) [15], HSC-yaduna waa unugyada ugu muhiimsan ee ku lug leh horumarka fibrosis-ka beerka. Beerku wuxuu ka kooban yahay noocyo badan oo unugyo ah, sidaa darteed moodooyinka kale ee unugyada sida nidaamka isku-dhafka unugyada difaaca jirka ee hepatocyte-HSC oo ay weheliso kicinta caspase iyo kala-goynta DNA-da iyo sidoo kale habka ficilka oo ay ku jirto heerka borotiinka waa in la tixgeliyaa si loo barto doorka IPA iyo isdhexgalka noocyada kale ee unugyada beerka.