Kala soocidda borotiinka ee marinnada qarsoon ayaa lagama maarmaan u ah ilaalinta qaybinta unugyada iyo homeostasis. Marka laga soo tago kala soocidda qolofka dhexdhexaadka ah, doorka lipids-ka ee kala soocidda kinesin ee habka gaadiidka qarsoon waa su'aal aasaasi ah oo muddo dheer soo jirtay oo aan weli laga jawaabin. Halkan, waxaan ku sameyneynaa sawir-qaadis 3D ah oo isku mar ah oo leh xallinta sare ee waqtiga-dhabta ah si aan u caddeyno in vivo in borotiinnada cusub ee la sameeyay ee glycosylphosphatidylinositol-ka ah ee aan dhaqdhaqaaq lahayn oo leh qaybo aad u dheer oo lipid ceramide ah ayaa la isku ururiyaa oo loo kala saaraa endoplasms gaar ah Goobta bixitaanka Net, taas oo ka duwan tan ay isticmaalaan borotiinnada transmembrane. Intaa waxaa dheer, waxaan muujineynaa in dhererka silsiladda ceramide ee xuubka reticulum-ka ee endoplasmic uu muhiim u yahay xulashadan kala soocidda. Daraasaddeennu waxay bixisaa caddayn toos ah oo ugu horreysa in vivo ah si loo kala saaro xamuulka borotiinka iyadoo lagu saleynayo dhererka silsiladda dufanka goobaha dhoofinta ee xulashada ah ee marinnada qarsoon.
Unugyada eukaryotic-ga, borotiinnada lagu sameeyay reticulum-ka endoplasmic (ER) ayaa markaa la kala saaraa inta lagu jiro gaadiidka iyada oo loo marayo marinka sirta ah si loogu geeyo meesha ay u socdaan unugyada ku habboon (1). Marka laga soo tago kala soocidda dahaarka dhexdhexaadka ah, waxaa muddo dheer la isla dhexmarayay in lipids-ka qaarkood ay sidoo kale u adeegi karaan meelo ka baxsan oo xulasho ah iyagoo u kala qaybinaya xuub gaar ah oo borotiinno gaar ah (2-5). Si kastaba ha ahaatee, weli waxaa jira caddayn toos ah oo ku jirta jirka si loo caddeeyo habkan ku salaysan lipid-ka ee suurtogalka ah. Si loo xalliyo dhibaatadan aasaasiga ah, waxaan ku barannay khamiirka sida borotiinnada glycosylphosphatidylinositol (GPI) ee ku xiran (GPI-APs) si kala duwan looga dhoofiyo ER. GPI-APs waa noocyo kala duwan oo borotiinno dusha sare ee unugyada ku xiran lipid-ka (6, 7). GPI-AP waa borotiin la soo saaray oo ku xiran warqadaha dibadda ee xuubka plasma iyada oo loo marayo qaybta glycolipid (barkinta GPI). Waxay aqbalaan barkinta GPI sidii wax ka beddello dib-tarjumaad ah oo ilaaliya lumen ER (8). Ka dib marka la isku xidho, GPI-AP waxay dhex martaa qalabka Golgi (5, 9) laga bilaabo ER ilaa xuubka balaasmaha. Joogitaanka barroosinnada GPI waxay sababtaa in GPI-AP si gaar ah looga qaado borotiinnada la soo saaray ee transmembrane (oo ay ku jiraan borotiinnada kale ee xuubka balaasmaha) oo ku teedsan marinka sirta (5, 9, 10). Unugyada khamiirka, GPI-APs waxaa laga soocaa borotiinnada kale ee la soo saaray ee ku jira reticulum-ka endoplasmic, ka dibna lagu duubo vesicles gaar ah oo lagu duubay isku-dhafka borotiinka jaakadda II (COPI) (6, 7). Waxyaabaha go'aamiya habkan kala-soocidda ee habka dhoofinta ER ma cadda, laakiin waxaa la qiyaasayaa in habkani uu u baahan karo lipids, gaar ahaan dib-u-habaynta qaab-dhismeedka qaybta lipid ee barroosinka GPI (5, 8). Khamiirka, dib-u-habaynta lipid-ka GPI waxay bilaabataa isla markiiba ka dib marka GPI ku xidhmo, xaalado badanna, waxay keentaa in ceramide uu ku xidhmo aashitada dufanka leh ee silsiladda dheer ee 26-kaarboon (C26:0) (11, 12). C26 ceramide waa ceramide-ka ugu weyn ee ay soo saaraan unugyada khamiirka ilaa hadda. Waxaa lagu farsameeyaa ER, inta badanna waxaa loo dhoofiyaa qalabka Golgi iyada oo loo marayo vesicles-ka COPII (13). Dhoofinta ER ee GPI-AP waxay si gaar ah ugu baahan tahay isku-darka ceramide ee socda (14, 15), beddelka ceramide ee inositol phosphate ceramide (IPC) ee qalabka Golgi waxay ku xiran tahay isku-darka GPI (16). Daraasadaha bayoolojiga ee xuubka macmalka ah ayaa muujiyay in ceramides silsiladda acyl ee aadka u dheer ay isku dari karaan si ay u sameeyaan domains nidaamsan oo leh sifooyin jireed oo gaar ah (17, 18). Xogtani waxay horseeddaa mala-awaalka ah in ceramide C26 iyo GPI-AP oo leh ceramide C26 ay isticmaalaan sifooyinkooda jireed si ay isugu daraan gobollo ama gobollo nidaamsan oo ku yaal deegaanka lipid-ka xuubka ER ee isku qasan. Inta badan waxay ka kooban tahay glycerolipids gaaban iyo kuwa aan dheregsanayn (C16:1 iyo C18:1) (19, 20). Gobolladan waxaa si gaar ah diiradda loogu saari doonaa goobaha gaarka ah ee laga baxo ER (ERES), halkaas oo ceramide iyo GPI-AP oo ku salaysan ceramide lagu geyn karo Golgi isla vesicle-ka COPII ee gaarka ah (5).
Daraasaddan, waxaan si toos ah u tijaabinay habkan ku salaysan lipid-ka annagoo adeegsanayna mikroskoobka sawir-qaadista waqtiga-dhabta ah ee aadka u xallinta badan (SCLIM), kaas oo ah farsamo mikroskoob casri ah oo isku mar daawan karta borotiinno fluorescent ah oo lagu calaamadeeyay. Sawirada saddexda midab leh iyo saddexda cabbir (3D) waxay leeyihiin xallin iyo xawaare aad u sarreeya oo ku jira unugyada nool (21, 22).
Marka hore waxaan adeegsannay tignoolajiyada SCLIM si aan u sii qeexno sida GPI-AP caadiga ah oo leh kooxda ceramide C26 looga baaray borotiinnada transmembrane ee la sii daayay ka dib markii ay ka baxeen ER ee S. cerevisiae. Si aan u hubinno kala soocidda ER, waxaan isticmaalnay nidaam hidde ah oo si toos ah u arki kara xamuul cusub oo la sameeyay oo galaya ERES in vivo (7, 23). Sida xamuul ahaan, waxaan doorannay GPI-AP Gas1 oo ku salaysan ceramide oo lagu calaamadeeyay borotiinka fluorescent cagaaran (GFP) iyo borotiinka transmembrane ee la sii daayay Mid2 oo lagu calaamadeeyay borotiinka fluorescent ee ku dhow infrared (iRFP), labaduba waxay bartilmaameedsadaan xuubka plasma (24-26). Isbeddelka heerkulka ee sec31-1, labadan xamuul waxaa lagu muujiyaa kor u qaade galactose-inducible iyo calaamadeeye ERES oo isku dhafan. Heerkulka aadka u daran (37°C), sababtoo ah isbeddelka sec31-1 wuxuu saameeyaa shaqada qaybta dahaarka COPII Sec31 si loo joojiyo biqilka COPII iyo dhoofinta ER, xamuulka cusub ee la soo saaray ayaa ku urura ER (23). Ka dib markii la qaboojiyey heerkul hoose (24°C), unugyada isbeddelka sec31-1 ayaa laga soo celiyey aagga sirta, xamuulkii cusbaa ee la ururiyayna waxaa laga bilaabay in laga dhoofiyo ER. Muuqaalka CLIM wuxuu muujiyay in inta badan Gas1-GFP iyo Mid2-iRFP ee cusub ee la sameeyay ay wali ku urureen ER-ka unugyada isbeddelka sec31-1 ka dib markii la geliyay heerkul ah 37°C ka dibna lagu sii daayay heerkul ah 24°C muddo 5 daqiiqo ah (Jaantuska 1). Maadaama Mid2-iRFP uu ku faafo xuubka ER oo dhan, Gas1-GFP-na uu ku urursan yahay oo lagu ururiyo aagga xuubka ER ee aan kala go'a lahayn, qaybintoodu way ka duwan tahay (Jaantuska 1, A ilaa C iyo Filimka S1). Intaa waxaa dheer, sida lagu muujiyey Jaantuska 1D, kooxda Gas1-GFP ma laha Mid2-iRFP. Natiijooyinkani waxay muujinayaan in borotiinnada GPI-AP iyo kuwa xuubka unugyada lagu kala saaray gobollada xuubka ER ee kala duwan goor hore. Kooxda Gas1-GFP waxay ku xigtaa ERES gaar ah oo lagu calaamadeeyay borotiinka joodariga ee mCherry's COPII Sec13 (Jaantuska 1, E iyo F, iyo filimka S1) (23).
Unugyada sec31-1 waxay muujiyaan dheecaanka uu keeno galactose, silsilad acyl dheer (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, cagaar) iyo borotiinka xuubka ee Mid2-iRFP (TMP, buluug) iyo calaamaddan ERES ee dhismaha leh ee Sec13-mCherry (ERES, magenta) ayaa lagu kululeeyay 37°C muddo 30 daqiiqo ah, waxaana loo wareejiyay 24°C, waxaana sawiray SCLIM 5 daqiiqo ka dib. (A ilaa C) waxay muujinaysaa sawir wakiil ah oo isku dhafan ama hal 2D ah oo ah diyaarad (A), sawir saadaalin 2D ah oo ah 10 qaybood oo z ah (B) ama sawir heer sare ah oo unug 3D ah oo ah xamuul iyo calaamado ERES (C). Barka cabbirka 1μm (A iyo B). Cutubka miisaanka waa 0.551μm (C). Gas1-GFP waxaa laga helay gobollada ER ee kala duwan ama kooxaha, halka Mid2-iRFP la ogaaday oo lagu qaybiyay xuubka ER (C). (D) Garaafku wuxuu muujinayaa xoogga iftiinka ee Gas1-GFP iyo Mid2-iRFP ee kooxda Gas1-GFP ee ku taal xariiqda fallaarta cad (bidix). AU, cutub aan kala sooc lahayn. (E iyo F) waxay matalaan sawirka 3D ee isku daraya alaabta iyo calaamadda ERES. Kooxaha Gas1-GFP waxaa laga helay meel u dhow ERES-ka gaarka ah. Cutubka miisaanka waa 0.551μm. (F) Fallaadha cad ee adag waxay calaamad u tahay kooxda Gas1-GFP ee la xiriirta ERES. Guddiyada dhexe iyo midig waxay muujinayaan sawirka 3D ee la isku daray ee la ballaariyay iyo aragti wareeg ah oo ku saabsan kooxda Gas1-GFP ee la doortay.
Xiriirka dhow ee u dhexeeya kooxda Gas1-GFP iyo ERES gaar ah wuxuu tilmaamayaa in Gas1-GFP uu geli karo ERES xulasho ah, kaas oo ka duwan xulashada ay isticmaasho Mid2-iRFP si ay uga baxdo ER. Si wax looga qabto suurtagalnimadaas, waxaan qiyaasnay ​​saamiga ERES ee hal ama laba badeecadood oo keliya (Jaantuska 2, A ilaa C). Waxaan ogaanay in inta badan ERES (70%) ay ka kooban yihiin hal nooc oo xamuul ah oo keliya. Sawirka hoose ee Jaantuska 2C wuxuu muujinayaa laba tusaale oo caadi ah oo ERES ah oo leh Gas1-GFP oo keliya (Jaantuska 1) ama Mid2-iRFP oo keliya (Jaantuska 2). Taas bedelkeeda, qiyaastii 20% ERES waxay ka kooban tahay laba xamuul oo isku dul saaran isla aagga. Waxaa la ogaaday in qaar ka mid ah ERES (10%) ay ka kooban yihiin laba nooc oo xamuul ah, laakiin lagu go'doomiyay meelo si cad u kala duwan. Sidaa darteed, falanqayntan tirakoobka waxay muujinaysaa in ka dib marka la dhoofiyo ER, GPI-AP Gas1-GFP iyo xamuulka xuubka ee Mid2-iRFP waxaa loo qaybiyaa ERES kala duwan (Jaantuska 2D). Waxtarka kala soociddani aad ayuu ula jaanqaadayaa falanqayntii hore ee bayoolajiyadda (6) iyo go'aaminta qaab-dhismeedka (7). Waxaan sidoo kale arki karnaa dhaqanka xamuulka karantiilka ah ee galaya ERES (Jaantuska 2E iyo Filimka S2). Jaantuska 2E wuxuu muujinayaa in qayb yar oo Gas1-GFP ah (qaybta 3) ama Mid2-iRFP (qaybta 4) ay ka soo gasho ERES hal dhinac oo ay ku kooban tahay aag go'an. Guddida 5 ee Jaantuska 2E waxay muujinaysaa in Gas1-GFP iyo Mid2-iRFP mararka qaarkood laga helo isla ERES-yada, laakiin waxay ka soo galaan dhinacyo kala duwan waxayna ku urursan yihiin gobollo kala duwan oo laga yaabo inay matalaan vesicles-ka COPII ee kala duwan. Waxaan sidoo kale xaqiijinay in kala soocidda la arkay iyo kala soocidda GPI-AP Gas1 ee ku salaysan ceramide ee C26 sida ERES-ka xulashada ah ay tahay mid gaar ah sababtoo ah xamuul kale oo dheecaan ah oo ku jira xuubka, borotiinka xuubka plasma ee calaamadda GFP ee Axl2 (27), oo muujinaya dhaqan la mid ah Mid2-iRFP. (Sawirka S1 iyo Filimka S3). Axl2-GFP-ga cusub ee la sameeyay waxaa lagu qaybiyaa xuubka ER sida Mid2-iRFP (Jaantuska S1, A iyo B), waxaana si isku mid ah loogu meeleeyay Mid2-iRFP inta badan ERES (Jaantuska S1, B ilaa D). Guddiyada 1 iyo 2 ee Jaantuska 1. S1C waxay muujinaysaa laba tusaale oo caadi ah oo ah ERES halkaas oo laba xamuul oo xumbo ah ay isku dul fadhiyaan. Xaaladahan, labada alaabba waxay wada galaan ERES (Jaantuska S1E, Guddiga 3 iyo Filimka S3).
Unugyada sec31-1 ee muujinaya dheecaanka galactose ee la kicin karo, Gas1-GFP (GPI-AP, cagaar) iyo Mid2-iRFP (TMP, buluug) iyo ERES calaamadaysan Sec13-mCherry (ERES, magenta) ayaa la dhigay 37 Ka dib markii la kululeeyay 30 daqiiqo °C, u dhaqaaq 24 °C si aad u sii deyso xannibaadda dheecaanka, iyo sawirka leh SCLIM 20 daqiiqo ka dib. (A ilaa C) Sawirrada saadaasha 2D ee matalaadda (A; baarka miisaanka, 1μm) ama sawirrada hemisphere-ka unugyada 3D (B iyo C; cutubka miisaanka, 0.456μm) ee xamuulka iyo 10 qaybood oo z ah oo lagu calaamadeeyay ERES. Guddiyada hoose ee (B) iyo guddiyada ku jira (C) waxay soo bandhigaan sawirro la farsameeyay si ay u muujiyaan oo keliya alaabta ku jirta ERES (magenta) [Gas1-GFP (cawlan) iyo Mid2-iRFP (buluug khafiif ah)]. (C) Fallaadha Furan: ERES waxay siddaa hal xabbo oo xamuul ah (1 ilaa 4). Fallaadha cawlan: ERES waxay ka kooban tahay xamuul kala soocan (5). Fallaadha cad ee adag: ERES waxay ka kooban tahay xamuul isku meel ah. Hoos: ERES-ka keliya ee la doortay wuxuu ka kooban yahay oo keliya Gas1-GFP (1) ama Mid2-iRFP (2). Barkadda miisaanka, 100 nm. (D) Tirada sawir-qaadista lagu sharraxay (C). Boqolleyda celceliska ERES ee ka kooban hal xabbo oo keliya (Gas1-GFP ama Mid2-iRFP), xamuul kala soocan iyo xamuul is dulsaaran. Saddex tijaabo oo madax-bannaan, n=432 54 unug. Barkadda qaladka = SD. Tijaabada t ee aan laba-dabo lahayn. *** P = 0.0002. (E) Sawirka 3D ee ERES-ka la xushay ee xamuulka karantiilka ah ee lagu calaamadeeyay (C). Gas1-GFP (cagaar) (3) ama Mid2-iRFP (buluug) (4) wuxuu ka soo galaa ERES (magenta) hal dhinac wuxuuna ku xaddidan yahay aag yar oo gudaha ERES ah. Mararka qaar, labada nooc ee xamuulka ah waxay ka soo galaan isla ERES (5) isla dhinac waxayna ku kooban yihiin meel go'doon ah oo ku taal ERES. Barka cabbirka, 100 nm.
Marka xigta, waxaan tijaabinay mala-awaal ah in silsiladda dheer ee acyl ceramide (C26) ee ku jirta xuubka ER ay ku kaxayso isku-darka iyo kala-soocidda gaarka ah ee Gas1 una beddesho ERES xulasho ah. Si taas loo gaaro, waxaan isticmaalnay nooc khamiir ah oo wax laga beddelay GhLag1, kaas oo labada isku-darka ceramide ee endogenous Lag1 iyo Lac1 lagu beddelay GhLag1 (oo ah isku-dhafka Lag1 ee cudbiga), taasoo keentay nooc khamiir leh oo leh nooc unug oo Ceramide ah oo ka gaaban nooca duurjoogta ah (Jaantuska 3A) (28). Falanqaynta Mass spectrometry (MS) waxay muujisay in noocyada duurjoogta ah, 95% ee wadarta ceramide ay aad u dheer tahay (C26) silsiladda ceramide, halka GhLag1, 85% ceramide-ku uu aad u dheer yahay (C18 iyo C16). ), kaliya 2% ceramide-ku waa mid aad u dheer (C26) silsiladda ceramide. In kasta oo ceramide-yada C18 iyo C16 ay yihiin ceramide-yada ugu muhiimsan ee laga helo xuubka GhLag1 ilaa hadda, falanqaynta MS waxay sidoo kale xaqiijisay in barroosinka GPI ee Gas1-GFP ee lagu muujiyey nooca GhLag1 uu ka kooban yahay ceramide C26, kaas oo la mid ah lipids-ka nooca duurjoogta ah. Tayadu waa isku mid (Jaantuska 3A) (26). Sidaa darteed, tani waxay ka dhigan tahay in enzyme-ka dib-u-habaynta ceramide-ka Cwh43 uu aad u xushay ceramide-ka C26, sida ku cad Jaantuska 26, waxay si gaar ah ugu daraysaa barroosinka GPI xaddi yar oo ceramide-ka C26 ah oo ku jira nooca GhLag1. S2 (29). Si kastaba ha ahaatee, xuubka unugyada ee GhLag1 asal ahaan wuxuu ka kooban yahay ceramide-ka C18-C16 oo keliya, halka Gas1-GFP uu wali leeyahay ceramide-ka C26. Xaqiiqadani waxay ka dhigaysaa noocaan qalab ku habboon si gaar ah loogu xalliyo dhibaatada dhererka silsiladda acyl ee ceramide-ka xuubka ee ER. Doorka mala-awaalka ah ee fasalka iyo kala-soocidda. Kadib, waxaan marka hore barannay awoodda C26 Gas1-GFP ay ugu ururto kooxo ku jira GhLag1 iyadoo la adeegsanayo allele mutant-ka heerkulka xasaasiga ah ee sec31-1 iyada oo loo marayo mikroskoobka fluorescence-ka caadiga ah, halkaas oo silsiladda dheer (C18-C16) oo keliya ay ku jirto xuubka ER Ceramide (Jaantuska 3). Waxaan aragnay in sec31-1, inta badan Gas1-GFP ay ku urursan tahay kooxo, halka Gas1-GFP ee sec31-1 GhLag1 oo leh xuubka ER ceramide dheer (C18-C16) aan inta badan la isku ururin oo lagu qaybiyay xuubka ER oo dhan. Si sax ah, sababtoo ah isku-dhafka ku salaysan ceramide ee C26 wuxuu si dhow ula xiriiraa ERES gaar ah (Jaantuska 1), waxaan marka xigta baarnay in habkani uu sidoo kale ku lug yeelan karo shaqada habka borotiinka dhoofinta ER. GPI-AP wuxuu adeegsadaa nidaam COPII gaar ah oo loogu talagalay dhoofinta ER, kaas oo si firfircoon u nidaamiya dib-u-habaynta qaab-dhismeedka Ted1 ee qaybta glycan ee barroosinka GPI (30, 31). GPI-glycan-ka dib-u-habaynta ah ayaa markaa lagu aqoonsadaa isku-dhafka qalabka soo-dhoweynta ee p24, kaas oo si gaar ah u qora Lst1, kaas oo ah isoform gaar ah oo ka mid ah qaybta ugu weyn ee isku-xidhka xamuulka ee COPII Sec24, isagoo samaynaya Vesicles COPII oo hodan ku ah GPI-AP (31-33). Sidaa darteed, waxaan dhisnay isbeddel labanlaab ah oo isku daray tirtirka borotiinnadan keli ah (qaybta isku-dhafan ee p24 Emp24, enzyme-ka dib-u-hagaajinta GPI-glycan Ted1 iyo qaybta gaarka ah ee COPII Lst1) oo leh nooca isbeddelka sec31-1, waxaanan barannay Ma suurtagal baa in la sameeyo GFP-cluster Gas1 (Jaantuska 3). Waxaan aragnay in sec31-1emp24Δ iyo sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP inta badan aan la ururin oo lagu qaybiyay xuubka ER, sida hore loogu arkay sec31-1 GhLag1, halka sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Like sec31-1. Natiijooyinkani waxay muujinayaan in marka lagu daro joogitaanka ceramide C26 ee xuubka ER, isku-darka Gas1-GFP sidoo kale wuxuu u baahan yahay inuu ku xidhmo dhismaha p24, mana u baahna shaqaaleysiin gaar ah oo Lst1 ah. Kadib, waxaan sahaminay suurtagalnimada in dhererka silsiladda ceramide ee xuubka ER uu nidaamin karo isku-xidhka Gas1-GFP ee p24. Si kastaba ha ahaatee, waxaan ogaanay in joogitaanka ceramide C18-C16 ee xuubka uusan saameyn ku yeelanayn GPI-glycans-ka dib loo dhisay isku-dhafka p24 (Jaantusyada S3 iyo S4, A iyo B) ama ku xidhnaanta GPI-AP iyo dhoofinta awoodda GPI-AP. Qoro nooca hoose ee COPII Lst1 (Jaantuska S4C). Sidaa darteed, isku-darka ku-tiirsan ceramide-ka C26 uma baahna isdhexgalka borotiinka ee hababka kala duwan ee borotiinka dhoofinta ER, laakiin wuxuu taageeraa farsamo kala-soocid kale oo uu wado dhererka lipid. Kadib, waxaan falanqeynay in dhererka silsiladda ceramide acyl ee xuubka ER uu muhiim u yahay kala-soocidda wax ku oolka ah ee Gas1-GFP sida ERES xulasho ah. Maadaama Gas1 ee nooca GhLag1 ee leh ceramide silsiladda gaaban uu ka tago ER oo uu galo xuubka balaasmaha (Jaantuska S5), waxaan aaminsanahay haddii kala-soocidda ay ku socoto dhererka silsiladda ceramide acyl, Gas1 ee nooca GhLag1 ayaa la wareejin karaa oo laga gudbi karaa. Alaabta ERES ee leh xuubka isku midka ah.
(A) Xuubka unugyada ee GhLag1 wuxuu inta badan ka kooban yahay ceramides C18-C16 oo gaaban, halka barroosinka GPI ee Gas1-GFP uu wali leeyahay isla C26 IPC sida unugyada nooca duurjoogta ah. Kor: falanqaynta dhererka silsiladda acyl ee ceramide ee xuubka unugyada ee noocyada nooca duurjoogta ah (Wt) iyo GhLag1p iyadoo la adeegsanayo spectrometry-ga cufka (MS). Xogtu waxay matalaysaa boqolkiiba wadarta ceramide. Celceliska saddex tijaabo oo madax-bannaan. Barroosinka qaladka = SD. Tijaabada t ee aan laba-dabo lahayn. **** P ＜0.0001. Guddi hoose: Falanqaynta MS ee dhererka silsiladda acyl ee IPC ee ku jirta barroosinka GPI ee Gas1-GFP (GPI-IPC) ee lagu muujiyay noocyada nooca duurjoogta ah iyo GhLag1p. Xogtu waxay matalaysaa boqolkiiba wadarta calaamadda IPC. Celceliska shan tijaabo oo madax-bannaan. Barroosinka qaladka = SD. Tijaabada t ee aan laba-dabo lahayn. ns, muhiim maaha. P = 0.9134. (B) Micrographs-ka fluorescence-ka ee sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ iyo sec31-1lst1Δ unugyada muujinaya Gas1-GFP-ga galactose-ka uu keeno ayaa lagu kululeeyay 37°C muddo 30 daqiiqo ah waxaana loo gudbiyay in lagu sameeyo microscopy-ga fluorescence-ka caadiga ah ka dib 24°C. Fallaadho cad: Kooxda ER Gas1-GFP. Fallaadho furan: Gas1-GFP oo aan kooxaysan ayaa lagu qaybiyaa xuubka ER oo dhan, taasoo muujinaysa rinjiyeynta giraanta nukliyeerka ee astaamaha ER. Barka cabbirka, 5μm. (C) Tirada sawir-qaadista lagu sharraxay (B). Boqolleyda celceliska unugyada leh qaab-dhismeedka Gas1-GFP ee la jeexjeexay. Saddex tijaabo oo madax-bannaan, n≥300 unug. Barka qaladka = SD. Tijaabada t ee aan laba-dabo lahayn. **** P ＜0.0001.
Si aan si toos ah u xallino dhibaatadan, waxaan sameynay muuqaal SCLIM ah oo Gas1-GFP iyo Mid2-iRFP ah oo ku jira GhLag1 iyadoo la adeegsanayo allele-ka sec31-1 ee heerkulka xasaasiga u ah (Jaantuska 4 iyo Filimka S4). Ka dib markii ER lagu hayay 37°C ka dibna lagu sii daayay 24°C, inta badan Gas1-GFP-ga cusub ee la sameeyay lama kala saarin oo laguma faafin xuubka ER oo dhan, sida lagu arkay mikroskoobyada caadiga ah (Jaantuska 4, A iyo B). Intaa waxaa dheer, boqolkiiba weyn ee ERES (67%) waxaa ku jira laba nooc oo xamuul ah oo isku xiran (Jaantuska 4D). Guddiyada 1 iyo 2 ee Jaantuska 4C waxay muujinayaan laba tusaale oo caadi ah oo ERES ah oo leh Gas1-GFP iyo Mid2-GFP oo is dulsaaran. Intaa waxaa dheer, labada alaabba waxaa lagu soo ururiyay isla ERES (Jaantuska 4E, guddiga 3 iyo filimka S4). Sidaa darteed, natiijooyinkayagu waxay muujinayaan in dhererka silsiladda acyl ee ceramide ee xuubka ER uu yahay go'aamiye muhiim ah oo ku saabsan isu-geynta iyo kala-soocidda borotiinka ER.
Unugyada Sec31-1 GhLag1 ee muujinaya dheecaanka uu keeno galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, cagaar) iyo Mid2-iRFP (TMP, buluug) iyo Sec13-mCherry (ERES, magenta) oo lagu calaamadeeyay ERES ku dul saar 37°C. Sii wad 30 daqiiqo, hoos ugu dhig 24°C si aad u sii deyso dheecaanka, oo sawir ku samee SCLIM 20 daqiiqo ka dib. (A ilaa C) Sawirrada saadaasha 2D ee matalaadda (A; baarka miisaanka, 1μm) ama sawirrada hemisphere-ka unugyada 3D (B iyo C; cutubka miisaanka, 0.45μm) ee 10-ka qaybood ee z oo lagu calaamadeeyay xamuulka iyo ERES. Guddiyada hoose ee (B) iyo guddiyada ku jira (C) waxay soo bandhigaan sawirro la farsameeyay si ay u muujiyaan oo keliya alaabta ku jirta ERES (magenta) [Gas1-GFP (cawlan) iyo Mid2-iRFP (buluug khafiif ah)]. (C) Fallaadha cad ee buuxsan: ERES, alaabtu way is dul saaran tahay. Fallaadha Furan: ERES waxay ka kooban tahay hal shay oo keliya. Guddi hoose: ERES-ka la doortay wuxuu leeyahay alaab is dulsaaran (1 iyo 2) oo lagu calaamadeeyay (C). Barka cabbirka, 100 nm. (D) Tirada sawir-qaadaha lagu sharraxay (C). Cutubka sec31-1 iyo sec31-1 GhLag1, hal xamuul oo keliya (Gas1-GFP ama Mid2-iRFP) ayaa ku jira, iyo celceliska boqolleyda ERES ee xamuulka go'doonsan iyo xamuulka is dulsaaran. Saddex tijaabo oo madax-bannaan, n = 432 54 unug (sec31-1) iyo n = 430 47 unug (sec31-1 GhLag1). Barka qaladka = SD. Tijaabada t ee aan la isku xidhin oo laba-dabo leh. *** P = 0.0002 (sec31-1) iyo ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Sawirka 3D ee ERES-ka la xushay oo leh xamuul is dulsaaran (3) oo lagu calaamadeeyay (C). Gas1-GFP (cagaar) iyo Mid2-iRFP (buluug) waxay u soo dhawaadaan ERES (magenta) iyagoo ka soo jeeda isla dhinac waxayna ku sii jiraan isla aagga xaddidan ee ERES. Barka cabbirka, 100 nm.
Daraasaddani waxay bixisaa caddayn toos ah oo ku saabsan in vivo in xamuulka borotiinka ku salaysan lipid-ka loo kala saaro goobo dhoofinta oo xulasho ah oo ku jira marinka sirta, waxayna muujineysaa muhiimadda dhererka silsiladda acyl ee xulashada kala soocidda. Annagoo adeegsanayna farsamo mikroskoob oo awood leh oo casri ah oo loo yaqaan SCLIM, waxaan soo bandhignay Gas1-GFP cusub oo la sameeyay (GPI-AP oo ah xuub plasma weyn oo leh silsilad acyl ah oo aad u dheer (C26) qayb lipid ceramide ah) oo khamiir ah) Gobollada lagu kala qaybiyay ER-yada kala duwan waxay la xiriiraan ERES gaar ah, halka borotiinnada la soo saaray ee transmembrane ay ku baahsan yihiin xuubka ER (Jaantuska 1). Intaa waxaa dheer, labadan nooc ee alaabta waxay si xulasho leh u galaan ERES kala duwan (Jaantuska 2). Dhererka silsiladda acyl ee ceramide-ka unugyada ee xuubka ayaa laga dhimay C26 ilaa C18-C16, kooxda Gas1-GFP waxaa lagu carqaladeeyay gobolka ER ee kala duwan, Gas1-GFP-na waxaa loo rogay inuu ka tago ER borotiinka transmembrane iyada oo loo marayo isla ERES-yada (Jaantuska 3 iyo Jaantuska 3). 4).
In kasta oo GPI-AP ay isticmaasho farsamo borotiin gaar ah si ay uga baxdo ER, waxaan ogaanay in kala-soocidda ku-tiirsan ceramide-ka C26 aysan ku tiirsanayn isdhexgalka borotiinka kala duwan ee keeni kara takhasuska ERES (Jaantusyada S4 iyo S5). Taa beddelkeeda, natiijooyinkayagu waxay taageerayaan hab kala-soocid kale oo ay horseeddo isku-darka borotiinka ku salaysan lipid-ka iyo ka-saarista xamuulka kale ee xiga. Indha-indheynteennu waxay tilmaamayaan in gobolka Gas1-GFP ama koox la xiriirta ERES gaar ah ay ka maqan tahay borotiinka lagu soo daayo xuubka unugyada ee Mid2-iRFP, taasoo tilmaamaysa in kooxda C26 ee ku-tiirsan ceramide-ka ee ku-tiirsan GPI-AP ay fududeyn doonto gelitaanka ERES-ka khuseeya, isla markaana, ay ka reebto xuubka unugyada. Qashinka wuxuu galayaa ERES-kan gaarka ah (Jaantusyada 1 iyo 2). Taas bedelkeeda, joogitaanka ceramide-yada C18-C16 ee xuubka ER ma keeno in GPI-AP ay sameyso gobollo ama kooxo, sidaa darteed ma ka saaraan ama ma beddelaan borotiinnada lagu soo daayo xuubka unugyada isla ERES-yada (Jaantusyada 3 iyo 4). Sidaa darteed, waxaan soo jeedinaynaa in ceramide-ka C26 uu kiciyo kala-soocidda iyo kala-soocidda iyadoo la fududeynayo isku-ururinta borotiinnada ku xiran ERES gaar ah.
Sidee loo gaaraa isku-ururintan ku-tiirsan ceramide-ka ee C26 oo loo gudbiyo aag ER gaar ah? U janjeera in ceramide-ka xuubka uu si dhinac ah u kala baxo waxay sababi kartaa in ceramide-ka GPI-AP iyo C26 ay sameeyaan lipids yaryar oo isla markiiba la kala soocay deegaanka lipid-ka ee aan caadiga ahayn ee xuubka ER oo ka kooban glycerolipids-ka gaagaaban iyo kuwa aan dheregsanayn. Kooxo tayo leh (17, 18). Kooxo yaryar oo ku meel gaar ah ayaa si dheeraad ah loogu dari karaa kooxo waaweyn oo deggan ka dib marka lagu xidho isku-ururinta p24 (34). Iyada oo la raacayo tan, waxaan tusnay in C26 Gas1-GFP ay u baahan tahay inay la falgasho isku-ururinta p24 si ay u samayso kooxo waaweyn oo muuqda (Jaantuska 3). Isku-ururinta p24 waa oligomer heterozygous ah oo ka kooban afar borotiin oo kala duwan oo p24 ah oo ku jira khamiirka (35), kaas oo bixiya isku-xidh badan, kaas oo horseedi kara isku-xidhka kooxo yaryar oo GPI-AP ah, taasoo keenta koox weyn oo deggan (34). Isdhexgalka ka dhexeeya ectodomain-yada borotiinka ee GPI-APs ayaa sidoo kale gacan ka geysan kara isku-darka, sida lagu muujiyay inta lagu jiro gaadiidka Golgi ee unugyada epithelial-ka ee naasleyda ah ee kala qaybsan (36). Si kastaba ha ahaatee, marka ceramide-ka C18-C16 uu ku jiro xuubka ER, marka isku-dhafka p24 uu ku xidhmo Gas1-GFP, kooxo waaweyn oo kala duwan lama samayn doono. Habka hoose wuxuu ku xirnaan karaa sifooyinka gaarka ah ee jireed iyo kiimikada ee ceramide-ka silsiladda acyl ee dheer. Daraasadaha bayoolojiga ee xuubka macmalka ah ayaa muujinaya in inkastoo ceramides-ka silsiladda acyl ee dheer (C24) iyo kuwa gaaban (C18-C16) ay sababi karaan kala-goynta wejiga, kaliya ceramides-ka silsiladda acyl ee dheer (C24) ayaa kor u qaadi kara qalooca sare iyo foorarsiga filimka si dib loogu qaabeeyo filimka. Iyada oo loo marayo tixraac labada dhinac ah (17, 37, 38). Waxaa la muujiyay in helix-ka xuubka unugyada ee TMED2, oo ah isku-dhafka aadanaha ee Emp24, uu si xushmad leh ula falgalo sphingomyelin-ka ku salaysan ceramide ee ku jira lobules-ka cytoplasmic (39). Annagoo adeegsanayna jilitaanka dhaqdhaqaaqa molecular (MD), waxaan ogaanay in ceramide-yada C18 iyo C26 ay ku ururaan agagaarka lobules-ka cytoplasmic ee helix-ka xuubka unugyada ... Marka GPI-AP ee ku jira lakabyada iftiinka si toos ah ugu xidhmaan p24 badan oo isku urursan oo ah ceramide C26 oo ku wareegsan p24 ee lakabyada cytoplasmic, waxay kor u qaadi kartaa isku-darka borotiinka ee la socda iyo qalooca xuubka ayaa laga soo saaraa faraha (41), taasoo keenta in GPI-AP ay u kala baxdo gobollo kala go'an oo ku xiga ERES, taas oo sidoo kale u janjeerta gobollada aadka u qaloocan ee xuubka ER (42). Warbixinnadii hore waxay taageereen habka la soo jeediyay (43, 44). Isku xidhka badan ee oligolectins, jeermisyada ama unugyada difaaca jirka ee glycosphingolipids (GSL) ee ku salaysan ceramide ee xuubka plasma wuxuu kiciyaa isku-darka GSL ee weyn, wuxuu xoojiyaa kala-soocidda wejiga wuxuuna sababaa isbeddelka xuubka iyo gudaha (44). Iwabuchi iwm. (43) Waxaa la ogaaday in joogitaanka silsiladaha acyl ee dheer (C24) laakiin aan gaabanayn (C16), ligand-ka multivalent ee ku xidhan lactosylceramide ee GSL uu sababay sameynta kooxo waaweyn iyo gelitaanka xuubka, iyo isbeddelka calaamadda ee ku dhex jira cytoplasm-ka ee Lyn ee ku yaal waraaqaha waxaa isku xira silsiladaha acyl ee neutrophils-ka isku xiran.
Unugyada epithelial-ka ee naasleyda ee kala qaybsan, isku-darka shabakadda ka hortagga Golgi (TGN) ilaa heerka xuubka plasma-ga ee apical wuxuu xakameeyaa kala-soocidda iyo kala-soocidda GPI-AP (10, 45). Isku-darkaan waxaa horseed u ah oligomerization-ka GPI-AP (36), laakiin waxay sidoo kale ku xirnaan kartaa dhererka silsiladda ceramide ee aan ka helno khamiirka. In kasta oo naasleyda GPI-AP ay leedahay barroosin ku salaysan lipid ether, qaab-dhismeedkeeduna uu aad uga duwan yahay ceramide silsiladda acyl ee aadka u dheer, daraasad dhowaan la sameeyay ayaa lagu ogaaday in labada lipids ay leeyihiin sifooyin jireed iyo kiimiko oo isku mid ah oo isbeddel ahaan ah iyo shaqo (40). Sidaa darteed, qaybta lipid-ka ether ee unugyada naasleyda waxay la mid noqon kartaa ceramide-ka C26 ee khamiirka, doorkeeduna waa inuu la xiriiro ceramide-ka silsiladda dheer ee xuubka si kor loogu qaado isu-geynta iyo kala-soocidda GPI-AP. In kasta oo suurtogalnimadan wali loo baahan yahay in si toos ah loo tijaabiyo, haddana natiijooyinkii hore waxay taageerayaan in rarista silsiladda dheer ee acyl ceramide ee jirka Golgi aan lagu fulin borotiinnada wareejinta cytoplasmic, laakiin waxay ku xiran tahay isku-darka barroosinnada GPI sida khamiirka. Sidaa darteed, habka muxaafidka ah ee isbeddelka ayaa u muuqda inuu awood u leeyahay inuu si xulasho ah isugu geeyo ceramide silsiladda acyl ee aadka u dheer iyo GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) isla vesicle-ka gaadiidka.
Nidaamyada unugyada epithelial-ka ee khamiirka iyo kuwa naasleyda ah ee kala fog, isku-darka GPI-AP iyo kala-soocidda borotiinnada kale ee xuubka balaasmaha dhammaantood waxay dhacaan ka hor inta aysan gaarin dusha sare ee unugga. Paladino et al. (48) waxay ogaadeen in TGN ee unugyada epithelial-ka ee kala fog ee naasleyda ah, isku-darka GPI-AP looma baahna oo keliya kala-soocidda xulashada ee GPI-APs ee xuubka balaasmaha ee kala fog, laakiin sidoo kale waxay xakameysaa abaabulka isku-dhafka ee GPI-APs iyo dhaqdhaqaaqeeda bayoolojiga. Dusha sare ee unugga. Daraasaddan waxay muujisay in kooxda C26 ee ku tiirsan GPI-AP ee ceramide ee ku taal ER ay nidaamin karto abaabulka kooxda iyo dhaqdhaqaaqa shaqada ee GPI-AP ee xuubka balaasmaha (24, 49). Iyada oo la raacayo qaabkan, unugyada GhLag1 waxay xasaasiyad ku leeyihiin daawooyinka joojiya GPI ama daawooyinka saameeya daacadnimada derbiga unugyada (28), iyo baahida loo qabo kooxaha Gas1-GFP ee shaqeynaya (49) ee ceramide-ka caarada ee lagu saadaaliyay isku-xidhka unugyada khamiirka waxay muujinaysaa G​​​ Cawaaqibta jireed ee suurtagalka ah ee unugyada hLag1. Khaladka GPI-AP. Si kastaba ha ahaatee, baaritaan dheeraad ah oo lagu sameeyo in qaab-dhismeedka shaqada ee dusha sare ee unugga laga barnaamijiyay ER iyadoo la adeegsanayo habka kala soocidda iyadoo lagu saleynayo dhererka dufanka ayaa noqon doona mawduuca cilmi-baaristayada mustaqbalka.
Noocyada Saccharomyces cerevisiae ee loo isticmaalay shaqadan waxaa lagu taxay Shaxda S1. Noocyada MMY1583 iyo MMY1635 ee SCLIM ee sawir-qaadista unugyada nool waxaa lagu dhisay asalka W303. Noocyadan muujinaya Sec13-mCherry oo leh calaamad borotiin fluorescent ah waxaa lagu dhisay iyadoo la adeegsanayo hab ku salaysan falgalka silsiladda polymerase (PCR) oo leh pFA6a plasmid oo ah qaab-dhismeed (23). Nooca muujinaya Mid2-iRFP oo lagu calaamadeeyay borotiin fluorescent ah oo hoos yimaada xakamaynta kor u qaadaha GAL1 ayaa loo dhisay sidan soo socota. Kordhinta PCR ee taxanaha iRFP-KanMx ee ka yimid vector-ka pKTiRFP-KAN (hadiyadda E. O'Shea, lambarka plasmid Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; aqoonsiga kheyraadka cilmi-baarista (RRID): Addgene_64687) Waxaana lagu geliyay C-terminus ee Mid2-da endogenous. Ka dib markii taxanaha hiddo-wadaha Mid2-iRFP la ballaariyay oo loo koobiyeeyay horumariyaha GAL1, waxaa lagu daray goobta Not I-Sac I ee isku-dhafka plasmid pRS306. PrGS7-kii plasmid ee ka dhashay waxaa lagu hagaajiyay Pst I si loogu daro goobta URA3.
Hidde-sidaha isku-dhafka Gas1-GFP waxaa lagu muujiyaa xakamaynta hormariyaha GAL1 ee ku jira plasmid-ka centromere (CEN), kaas oo loo sameeyay sidan soo socota. Taxanaha Gas1-GFP waxaa lagu xoojiyay PCR laga bilaabo plasmid-ka pRS416-GAS1-GFP (24) (hadiyadda L. Popolo) waxaana loo koobiyeeyay goobta Xma I–Xho I ee plasmid-ka CEN pBEVY-GL LEU2 (hadiyadda C). Miller; Lambarka plasmid-ka Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmid-ka ka dhashay waxaa loogu magac daray pRGS6. Hidde-sidaha isku-dhafka Axl2-GFP waxaa sidoo kale lagu muujiyaa xakamaynta hormariyaha GAL1 ee vector-ka pBEVY-GL LEU2, dhismihiisana waa sida soo socota. Taxanaha Axl2-GFP waxaa laga kordhiyay plasmid pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) iyadoo la adeegsanayo PCR, waxaana lagu koobiyeeyay goobta Bam HI-Pst I ee vector-ka pBEVY-GL LEU2. Plasmid-ka ka dhashay waxaa loogu magac daray pRGS12. Taxanaha oligonucleotides-ka loo isticmaalay daraasaddan waxaa lagu taxay Shaxda S2.
Nooca waxaa lagu kabay 0.2% adenine iyo 2% gulukoos [YP-dextrose (YPD)], 2% raffinose [YP-raffinose] borotiin khamiir hodan ah p (YP) dhexdhexaad ah (1% soosaar khamiir iyo 2% borotiin ept). (YPR)] ama 2% galactose [YP-galactose (YPG)] oo ah isha kaarboonka, ama dhexdhexaad yar oo macmal ah (0.15% saldhig nitrogen khamiir iyo 0.5% ammonium sulfate) si loogu kabo amino acids iyo saldhigyada ku habboon ee loogu baahan yahay nafaqada, Iyo sidoo kale 2% gulukoos (dhexdhexaad yar oo sonkor ah) ama 2% galactose (dhexdhexaad yar oo sonkor ah) oo ah isha kaarboonka.
Sawir-qaadista waqtiga-dhabta ah, unugyada isbeddelka heerkulka xasaasiga ah ee sec31-1 ee muujinaya dhismaha hoos yimaada dhiirrigeliyaha GAL1 ayaa lagu koray dhexdhexaadka YPR 24°C habeenkii ilaa marxaladda dhexe ee log. Ka dib markii lagu kiciyay YPG 24°C muddo 1 saac ah, unugyada waxaa lagu kululeeyay SG 37°C muddo 30 daqiiqo ah, ka dibna waxaa loo wareejiyay 24°C si looga sii daayo baloogga dheecaanka. Concanavalin A waxaa loo isticmaalay in lagu hagaajiyo unugyada muraayadda lagu sawiray oo lagu sawiray SCLIM. SCLIM waa isku-darka mikroskoobka iftiinka ee Olympus IX-71 ee la rogay iyo muraayadda saliidda ee UPlanSApo 100×1.4 ee tirada leh (Olympus), iskaanka isku-dhafka ah ee disk-ka ee xawaaraha sare iyo saamiga sare ee calaamadda-ilaa-qaylada (Yokogawa Electric), cabbiraha gaarka ah, iyo qaboojinta gaarka ah. Xoojinta sawirka nidaamka (Hamamatsu Photonics) waxay bixin kartaa nidaam muraayad weynayn leh oo leh weynayn kama dambays ah oo ah ×266.7 iyo kamarad qalab oo isku xiran oo taraysa elektaroonada (Hamamatsu Photonics) (21). Helitaanka sawirka waxaa sameeya software gaar ah (Yokogawa Electric). Sawirada 3D, waxaan u isticmaalnay firfircooni piezoelectric ah oo gaar ah si aan si toosan ugu gariirino muraayadda ujeeddada, waxaanan qaybaha indhaha u ururinay 100 nm oo kala fog. Sawirka Z-stack waxaa loo beddelaa xog voxel 3D ah, shaqada faafinta dhibcaha ee loo isticmaalo mikroskoobka isku-dhafka ah ee saxanka wareegaya waxaa loo isticmaalaa habaynta kala-goynta iyadoo la adeegsanayo barnaamijka Volocity (PerkinElmer). Iyadoo la adeegsanayo barnaamijka Volocity si si toos ah loogu cabbiro falanqaynta goobta wadajirka ah, ERES oo ay ku jiraan xamuulka ayaa la cabbiray. Falanqaynta sawir-qaadista xariiqda waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka MetaMorph (Qalabka Molecular).
Adeegso barnaamijka GraphPad Prism si aad u go'aamiso muhiimadda tirakoobka. Imtixaanka t-ga ee ardayga ee laba-dabo leh iyo imtixaanka caadiga ah ee falanqaynta hal-geesoodka ah ee kala duwanaanshaha (ANOVA), kala duwanaanshaha u dhexeeya kooxaha waxaa loo arkaa inay saameyn weyn ku leeyihiin P <0.05 (*).
Si loo eego mikroskoobka fluorescence ee Gas1-GFP, unugyada marxaladda log-ka ayaa habeenkii lagu koray YPD waxaana lagu soo ururiyay centrifugation, laba jeer ayaa lagu dhaqay cusbada fosfate-ka ee la shiiday, waxaana lagu kululeeyay barafka ugu yaraan 15 daqiiqo, ka dibna waxaa lagu sii waday mikroskoobka sida hore loogu sharaxay Hubi (24). Mikroskoobka Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 saliid PH3 CS) oo lagu qalabeeyay muraayad ujeedo leh, shaandhada L5 (GFP), kamaradda Hamamatsu iyo barnaamijka Application Suite X (LAS X) ayaa loo isticmaalay iibsiga.
Shaybaarrada waxaa lagu sameeyay shaandho SDS ah oo heerkulkeedu yahay 65°C muddo 10 daqiiqo ah, ka dibna waxaa lagu kala saaray SDS-polyacrylamide jel electrophoresis (PAGE). Falanqaynta immunoblotting-ka, 10 μl oo muunad ah ayaa la raray halkii dariiq. Antibody-ga aasaasiga ah: Isticmaal polyclonal anti-Gas1 oo bakayle ah oo lagu milmay 1:3000, polyclonal anti-Emp24 oo bakayle ah oo lagu milmay 1:500, iyo polyclonal anti-GFP oo bakayle ah (hadiyad ka timid H. Riezman) oo lagu milmay 1:3000. Antibody-ga jiirka ee monoclonal anti-Pgk1 waxaa loo isticmaalay milmay 1:5000 (hadiyad ka timid J. de la Cruz). Antibody-ga labaad: Horseradish peroxidase (HRP) oo ah riyaha isku dhafan ee anti-bakayle immunoglobulin G (IgG) oo loo isticmaalay milmay 1:3000 (Pierce). IgG-ga ariga ee isku xiran ee ka hortagga jiirka ayaa loo isticmaalay 1:3000 (Pierce). Aagga jawaabta difaaca jirka waxaa lagu arkay habka kiimikada ee SuperSignal West Pico reagent (Thermo Fisher Scientific).
Sida lagu sharraxay (31), tijaabo difaac dabiici ah ayaa lagu sameeyay jajabka ER ee hodanka ah. Marka la soo koobo, ku dhaq unugyada khamiirka leh TNE buffer [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride iyo isku darka protease inhibitor) 600 nm (OD600) 100 cufnaanta indhaha laba jeer. Waxaa lagu jabiyay kuul galaas ah, ka dibna burburka unugyada iyo kuul galaas ah ayaa laga saaray centrifugation. Dabadeed waxaa la centrifugation lagu sameeyay 17,000 g muddo 15 daqiiqo ah 4°C. Kalluunka ayaa dib loogu celiyay TNE waxaana lagu daray digitalis saponin si loo helo isku-darka ugu dambeeya ee 1%. Joojinta waxaa la geliyay 1 saac iyadoo lagu wareejinayo 4°C, ka dibna qaybaha aan milmi karin waxaa laga saaray centrifugation 13,000 g heerkul ah 4°C muddo 60 daqiiqo ah. Si aad u hesho difaac sare oo Gas1-GFP ah, marka hore muunadda ku sii daa kuul agarose ah oo madhan (ChromoTek) heerkul ah 4°C muddo 1 saac ah, ka dibna ku dar GFP-Trap_A (ChromoTek) heerkul ah 4°C muddo 3 saacadood ah. Kuulka difaaca jirka ee la dilay waxaa shan jeer lagu dhaqay TNE oo ka kooban 0.2% digoxigenin, waxaana lagu shubay kaydka muunadda SDS, waxaana lagu kala saaray SDS-PAGE, waxaana lagu falanqeeyay immunoblotting.
Sida lagu sharraxay (31), go'aaminta isku-xidhka isku-xidhka waxaa lagu sameeyay jajabka ER ee la kobciyey. Si kooban, jajabka ER ee la kobciyey waxaa lagu dhex daray 0.5 mM dithiobis(succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 daqiiqo). Falcelinta isku-xidhka isku-xidhka waxaa lagu damiyey iyadoo lagu daray glycine (50 mM fiirsashada ugu dambeysa, 5 daqiiqo, 20°C).
Sida hore loo sharraxay (50), falanqaynta MS ee ceramide ee noocyada duurjoogta ah iyo GhLag1 ayaa la sameeyay. Marka la soo koobo, unugyada waxaa loo koray marxaladda exponential (3 ilaa 4 unug oo OD600 ah/ml) YPD heerkulkiisu yahay 30°C, waxaana la goostay 25×107 unug. Dheef-shiid kiimikaadkooda waxaa lagu damiyay aashitada trichloroacetic. Isticmaal dareeraha soo saarista [ethanol, biyo, ether, pyridine iyo 4.2 N ammonium hydroxide (15:15:5:1:0.018 v/v)] iyo 1.2 nmol oo ah tayada gudaha ee C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid)). Isticmaal reagent monomethylamine [methanol, biyo, n-butanol iyo xalka methylamine (4:3:1:5 v/v)] si aad u sameyso hydrolysis alkaline khafiif ah oo laga soo saaray, ka dibna isticmaal n-butanol biyo-buuxa ah si aad u kala saarto. Ugu dambeyntii, soo-saarkii waxaa dib loogu celiyey dareere qaab wanaagsan [chloroform/methanol/biyo (2:7:1) + 5 mM ammonium acetate] waxaana lagu duray cabbiraha cufka. La socodka fal-celinta badan (MRM) ayaa la sameeyay si loo aqoonsado loona qiyaaso molecules-ka sphingolipid. Qalabka cabbiraha cufka saddex-geesoodka ah ee TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) waxaa ku qalabaysan isha robotic-ka ah ee nanoflow ion Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) si loo falanqeeyo dufanka. Tamarta isku dhaca waxaa loo habeeyay qayb kasta oo ceramide ah. Xogta MS waxaa lagu helay qaab togan. Nooc kasta oo bayooloji ah, calaamadda dufanka waa dhexdhexaadka saddex cabbir oo madax-bannaan.
Sida lagu sharraxay (31), unugyada (800×107) ee muujinaya Gas1-GFP waxaa lagu sameeyay difaac dabiici ah. Gas1-GFP-ga la nadiifiyey waxaa kala soocay SDS-PAGE waxaana loo wareejiyay xuub polyvinylidene fluoride (PVDF). Borotiinku waxaa lagu sawiray iyadoo lagu rinjiyeynayo PVDF madow oo amide ah. Xarig Gas1-GFP waxaa laga jaray PVDF waxaana lagu dhaqay 5 jeer methanol iyo hal mar biyo dareere ah oo chromatography-MS (LC-MS). Iyadoo lagu kululeynayo xarigga xuubka 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), buffer iyo 500μl oo cusub oo milmay 1 M sodium nitrite heerkul ah 37°C muddo 3 saacadood ah, jajabka lipid-ka ayaa laga sii daayaa Gas1-GFP waxaana la lysed Soo deynta inosine phosphate ceramide inta u dhaxaysa glucosamine iyo inositol (51). Intaa ka dib, xarigga xuubka waxaa afar jeer lagu dhaqay biyo heerka LC-MS ah, waxaana lagu qalajiyey heerkulka qolka, waxaana lagu kaydiyey jawi nitrogen ah oo ah -80°C ilaa la falanqeeyo. Si loo xakameeyo, muunad madhan oo xuubka PVDF ah ayaa loo isticmaalay tijaabo kasta. Dufanka laga soo saaray Gas1-GFP ayaa markaa MS uu falanqeeyey sida lagu sharraxay (50). Marka la soo koobo, xarigga PVDF ee ka kooban GPI-lipid ayaa dib loogu celiyey dareeraha caaryada ee 75μl [chloroform/methanol (1:2) + 5 mM ammonium acetate] waxaana la mariyey electrospray ionization (ESI)-MRM/MS Falanqaynta noocyada sphingolipid (TSQ Vantage). Xaaladdan, xogta MS waxaa lagu helay qaab ion taban.
Sida hore loo soo sheegay, qaybta dufanka ee barroosinka GPI waxaa laga soocay [3H]-inositol-lagu calaamadeeyay GPI-AP (16). Lipids-ka waxaa lagu kala saaray koromagrafi lakab khafiif ah iyadoo la adeegsanayo nidaam dareere ah (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) waxaana lagu sawiray iyadoo la adeegsanayo FLA-7000 (Fujifilm).
Unugyada muujinaya Gas1-GFP (600×107) waxaa laba jeer lagu dhaqay TNE buffer oo leh TNE buffer, ka dibna lagu jebiyey kuul galaas ah, ka dibna lagu dhex shubay si looga saaro qashinka unugyada iyo kuul galaas ah. Dabadeed waxaa lagu dhex shubay 17,000 g muddo 1 saac ah heerkul ah 4°C. Kaabsalkii waxaa lagu dhaqay TNE waxaana lagu dhex shubay 1 U PI-PLC (Invitrogen) oo ku jirta TNE oo ay ku jiraan 0.2% saponin digitalis ah muddo 1 saac ah heerkul ah 37°C. Daawaynta ensaymka ka dib, xuubka waxaa laga saaray centrifugation 17,000 g heerkul ah 4°C muddo 1 saac ah. Si loo ilaaliyo difaaca jirka ee Gas1-GFP, dusha sare waxaa lagu dhex shubay GFP-Trap_A (ChromoTek) heerkul ah 4°C habeenkii. Gas1-GFP oo la nadiifiyey oo ay kala sooceen SDS-PAGE waxaa lagu rinjiyeeyay buluug dhalaalaya oo Coomassie ah. Xarigga rinjiyeynta Gas1-GFP ayaa laga jaray cawlka ku hareeraysan marin biyoodka, ka dibna ka dib alkylation-ka iodoacetamide iyo dhimista dithiothreitol, dheefshiidka gudaha gel-ka ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo trypsin. Soo saar oo qalaji peptides-ka tryptic iyo peptides-ka GPI-glycans. Peptide-ka qalalan waxaa lagu milmay 20 μl oo biyo ah. Ku duri qayb (8μl) LC. Tiirka octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; dhexroorka gudaha 150 mm × 1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japan) ayaa loo isticmaalay in lagu kala saaro peptides-ka xaaladaha gaarka ah ee heerka. Marxaladda guurguura waa dareeraha A (0.08% formic acid) iyo dareeraha B (0.15% formic acid oo ku jira 80% acetonitrile). Nidaamka Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) ayaa loo isticmaalay in lagu nadiifiyo tiirka dareeraha A 55 daqiiqo gudahood iyadoo heerka socodka uu yahay 50 μl min-1 muddo 5 daqiiqo ah, ka dibna xoojinta dareeraha B ayaa la kordhiyay ilaa 40%. , Mareykanka). Eluate-ka waxaa si joogto ah loogu soo bandhigay isha ion-ka ESI, peptide-yada tryptic-ka iyo peptide-yada leh GPI-glycans waxaa falanqeeyay LTQ Orbitrap XL (oo ah cabbiraha isku-dhafka ah ee ion trap-orbitrap mass spectrometer; Thermo Fisher Scientific). Dejinta MS, danabka isha xididka waxaa loo dejiyay 4.5 kV, heerkulka xididdada wareeggana waxaa lagu hayay 300°C. Danabka xididdada dhiigga iyo danabka muraayadaha tuubada waxaa loo dejiyay 15 V iyo 50 V, siday u kala horreeyaan. Xogta MS waxaa lagu helay qaabka ion-ka togan (xallinta 60,000; saxnaanta tirada 10 qaybood halkii milyan) oo ah kala duwanaansho cufnaan ah oo ah 300/m/z saamiga cufnaanta/kharashka (m/z) 3000. Xogta MS/MS waxaa laga helaa dabinka ion-ka ee LTQ Orbitrap XL [3da lambar ee ugu horreeya ee xogtu ku tiirsan tahay, kala-goynta isku dhaca ee keentay (CID)].
Jilitaannada MD waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka GROMACS (52) iyo goobta xoogga MARTINI 2 (53-55). Dhismaha xuubka CHARMM GUI (56, 57) ayaa markaa loo isticmaalay in lagu dhiso lakab laba-jibbaaran oo ka kooban dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) iyo Cer C18 ama DOPC iyo Cer C26. Qaab-dhismeedka iyo isku-dubaridka Cer C26 waxaa laga soo qaatay DXCE iyadoo laga saarayo kuullada dheeraadka ah ee dabada sphingosine. Isticmaal habka hoos lagu sharraxay si aad isugu dheellitirto lakabka labanlaab ah oo aad u socodsiiso, ka dibna isticmaal isku-dubaridka ugu dambeeya ee nidaamka si aad u dhisto nidaam ka kooban Emp24. Qaybta xuubka ee khamiirka Emp24 (hadhaaga 173 ilaa 193) waxaa loo dhisay sidii α-helix iyadoo la adeegsanayo qaab-dhismeedka molecular-ka qalabka MD (VMD) ee muuqaalka ah (58). Kadib, ka dib markii laga saaray lipids-ka is dulsaaran, borotiinka si qallafsan ayaa loo shiiday oo lagu geliyay lakabka laba-jibbaaran iyadoo la adeegsanayo CHARMM GUI. Nidaamka kama dambaysta ah wuxuu ka kooban yahay 1202 DOPC iyo 302 Cer C26 ama 1197 DOPC iyo 295 Cer C18 iyo Emp24. Nidaamka ku shub nusqaamo dhan 0.150M. Afar nuqul oo madax-bannaan ayaa loo sameeyay laba halabuur oo laba lakab ah.
Lakabka laba-jibbaaran ee lipid-ka ayaa lagu dheellitiraa iyadoo la adeegsanayo habka CHARMM GUI, kaas oo ku lug leh yaraynta ka dibna isku dheelitirka 405,000 oo tallaabo, halkaas oo xaddidaadaha booska si tartiib tartiib ah loo yareeyo oo loo baabi'iyo, tallaabada waqtigana laga kordhiyo 0.005 ps ilaa 0.02 ps. Ka dib is-waafajinta, waxay soo saartaa 6 µs oo leh tallaabo waqti ah oo ah 0.02 ps. Ka dib markaad geliso Emp24, isticmaal isla habka CHARMM GUI si aad u yareyso oo aad u dheellitirto nidaamka, ka dibna u socodsii 8 ilbiriqsi wax soo saarka.
Dhammaan nidaamyada, inta lagu jiro habka dheelitirka, cadaadiska waxaa xakameeya Berendsen barostat (59), inta lagu jiro habka wax soo saarka, cadaadiska waxaa xakameeya Parrinello-Rahman barostat (60). Dhammaan kiisaska, cadaadiska celceliska waa 1 bar waxaana la isticmaalaa nidaam isku xidhka cadaadiska nus-isotropic ah. Habka dheelitirka iyo wax soo saarka, heerkulbeeg (61) oo leh dib-u-habayn xawaare ah ayaa loo isticmaalaa in lagu xidho heerkulka borotiinka, dufanka iyo walxaha dareeraha siday u kala horreeyaan. Inta lagu jiro hawlgalka oo dhan, heerkulka bartilmaameedku waa 310K. Isdhexgalka aan xidhnayn waxaa lagu xisaabiyaa iyadoo la soo saarayo liis isku-xidhan iyadoo la adeegsanayo nidaamka Verlet oo leh dulqaad 0.005 kayd ah. Ereyga Coulomb waxaa lagu xisaabiyaa iyadoo la adeegsanayo goobta falgalka iyo masaafada goynta ee 1.1 nm. Ereyga Vander Waals wuxuu isticmaalaa nidaam goyn oo leh masaafada goynta ee 1.1 nm, nidaamka goynta Verlet-kana waxaa loo isticmaalaa qulqulka suurtagalka ah (62).
Iyada oo la adeegsanayo VMD, mowjadda goynta ee u dhaxaysa DOPC fosfate kuul ama ceramide AM1 kuul iyo borotiinku waa 0.7 nm, tirada lipids-ka ee la falgala borotiinkana waa la xisaabiyaa. Sida ku cad qaacidada soo socota, xisaabi qodobka hoos u dhaca-horumarinta (DE) sida ku cad (63): DE factor = (tirada guud ee lipids-ka ku jira borotiinka 0.7) ee borotiinka 0.7 (tirada Cer ee wadarta lipids-ka)
Qiimaha la soo sheegay waxaa loo helaa celcelis ahaan, baararka khaladaadkana waa afar nuqul oo madax-bannaan oo SE ah. Muhiimadda tirakoobka ee qodobka DE waxaa lagu xisaabiyaa tijaabada t [(celceliska DE-factor-1)/SE]. Xisaabi qiimaha P laga bilaabo qaybinta hal-dabo leh.
Qalabka GROMACS waxaa loo isticmaalay in lagu xisaabiyo khariidadda cufnaanta dhinaca 2D ee nidaamka ka kooban Emp24 gudaha 250 ns ee ugu dambeeya ee raadadka. Si loo helo khariidadda kobcinta/dhammaystirka ceramide, khariidadda cufnaanta ee Cer waxaa loo qaybiyaa wadarta khariidadda Cer iyo DOPC, ka dibna waxaa loo qaybiyaa xoogga Cer ee jirka. Cabbirka khariidadda midabka isku mid ah ayaa la isticmaalaa.
Wixii agab dheeraad ah ee maqaalkan, fadlan eeg http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Kani waa maqaal furan oo loo qaybiyay shuruudaha Ruqsadda Hal-abuurka ee Aan Ganacsiga ahayn, kaas oo u oggolaanaya isticmaalka, qaybinta iyo taranka wax kasta oo warbaahin ah, ilaa inta isticmaalka kama dambaysta ah uusan ahayn mid loogu talagalay faa'iido ganacsi iyo ujeeddada laga leeyahay in shaqadii asalka ahayd ay sax tahay. Tixraac.
Fiiro gaar ah: Waxaan kaa codsaneynaa oo keliya inaad bixiso cinwaankaaga emaylka si qofka aad bogga kula taliso uu u ogaado inaad rabto inuu arko emaylka iyo in uusan ahayn spam. Ma qaban doonno wax cinwaanada emaylka ah.
Su'aashan waxaa loo isticmaalaa in lagu tijaabiyo inaad tahay booqde iyo in laga hortago gudbinta spam-ka ee otomaatiga ah.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Wapez) (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Sawir-qaadista waqtiga-dhabta ah ee xallinta sare leh ee 3D waxay muujinaysaa muhiimadda dhererka silsiladda ceramide ee kala-soocidda borotiinka ee goobaha wax soo saarka ee la xushay.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Wapez) (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Sawir-qaadista waqtiga-dhabta ah ee xallinta sare leh ee 3D waxay muujinaysaa muhiimadda dhererka silsiladda ceramide ee kala-soocidda borotiinka ee goobaha wax soo saarka ee la xushay.
©2020 Ururka Maraykanka ee Horumarinta Sayniska. xuquuqda oo dhan way xifdisan yihiin. AAAS waa lammaane HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef iyo COUNTER. Horumarka Sayniska ISSN 2375-2548.