Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com. Nooca biraawsarka aad isticmaaleyso wuxuu leeyahay taageero xaddidan oo CSS ah. Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho biraawsar la cusbooneysiiyay (ama aad damiso qaabka is-waafajinta ee Internet Explorer). Dhanka kale, si loo hubiyo taageerada joogtada ah, waxaan soo bandhigi doonnaa goobta iyada oo aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Si ka duwan laf-dhabarta, cayayaanka waxaa si weyn loo aaminsan yahay inaysan lahayn hoormoonno steroid galmo oo ragga u janjeera. Anopheles gambiae, steroid ecdysone 20-hydroxyecdysone (20E) waxay u muuqataa inay horumarisay si ay u xakameyso koritaanka ukunta marka ay sameeyaan dheddigga2 iyo inay kiciso muddo is-guursi ah oo aan la isku guursan marka ay galmo ahaan u gudbiyaan ragga3. Maadaama horumarinta ukunta iyo isku-guurku ay yihiin astaamo taran oo muhiim ah, fahamka sida kaneecada Anopheles ee dheddigga ah ay u dhexgalaan calaamadahan hoormoonka ayaa sahli kara naqshadeynta barnaamijyada cusub ee xakamaynta duumada. Halkan, waxaan ku soo bandhigaynaa in hawlahan taranka ay nidaamiyaan steroids galmo oo kala duwan iyada oo loo marayo shabakad adag oo enzymes-ka firfircoon/dhaqdhaqaaqa ecdysteroid ah. Waxaan aqoonsannay ecdysone oxidized oo gaar ah oo lab ah, 3-dehydro-20E (3D20E), kaas oo ilaaliya waalidnimada isagoo xiraya soo dhawaynta galmada dheddigga ka dib wareejinta galmada iyo kicinta dephosphorylation. Waxaa xusid mudan, wareejinta 3D20E waxay sidoo kale kicisay muujinta hiddo-sideyaasha taranka ee ilaaliya horumarka ukunta inta lagu jiro caabuqa Plasmodium, taasoo hubinaysa caafimaadka dheddigga cudurka qaba. 20E ee laga soo qaatay dheddigga ma keeno galmo. jawaab celin, laakiin waxay u oggolaanaysaa shakhsiyaadka isku jinsiga ah inay ukunta dhigaan ka dib marka la joojiyo kinase-yada 20E-inhibiting. Aqoonsiga hoormoonkan steroid-ka cayayaanka ee gaarka ah ee ragga iyo doorkiisa ku aaddan nidaaminta soo dhawaynta galmada dumarka, bacriminta iyo isdhexgalka Plasmodium waxay soo jeedinaysaa suurtagalnimada in la yareeyo guusha taranka ee kaneecada gudbisa duumada.
Kiisaska iyo dhimashada duumada ayaa mar kale sii kordhaya4 sababtoo ah iska caabbinta sunta cayayaanka ee baahsan ee kaneecada Anopheles, oo ah nooca kaliya ee keena dulinleyda duumada aadanaha. Bayoolajiga isku-dhafka ee kaneecadani waa bartilmaameed gaar ah oo soo jiidasho leh oo loogu talagalay waxqabadyada cusub ee xakamaynta duumada sababtoo ah dumarku hal mar oo keliya ayay is-guursadaan; ka dhigista dhacdadan isku-guurka ah mid nadiif ah waxay yeelan doontaa awood weyn oo lagu yarayn karo tirada kaneecada ee goobta ku jirta.
Dumarku waxay noqdaan kuwo aan awood u lahayn galmada ka dib markay helaan hoormoonada steroid-ka ee ragga. Daraasaduhu waxay muujiyeen in kicinta dhibka galmada ee dheeraadka ah ay tahay 20-hydroxyecdysone (20E), oo ah hoormoon steroid ah oo si fiican loogu yaqaan nidaamiyaha wareegga molting-ka marxaladda dirxiga. Awoodda ragga ee ay ku abuuri karaan oo ay u gudbin karaan 20E ayaa si gaar ah uga soo ifbaxday noocyada Anopheles oo qayb ka ah unugyada hoose ee Cellia7, kaas oo ku baahsan Afrika oo ay ku jiraan kuwa ugu khatarta badan ee duumada, oo ay ku jiraan Anopheles gambiae. Tani waa mid si gaar ah loo xusayo sababtoo ah noocyadan dheddiggu waxay sidoo kale soo saaraan 20E ka dib cunto kasta oo dhiig ah, 20E-na waxay kicisaa wareegga oogenesis (fiiri tixraaca 8). Si kastaba ha ahaatee, wax yar ayaa laga ogyahay habka ay dheddiggu isugu daraan calaamadaha laba ilo oo kala duwan oo ecdysone ah (wareejinta labka iyo kicinta quudinta dhiigga) iyagoon wax u dhimayn awooddooda ay ku guursadaan. Xaqiiqdii, haddii 20E ay soo saarto dheddiggu ay kiciso dulqaad la'aanta galmada, tani waxay u horseedi doontaa dhalmo la'aan shakhsiyaadka bikrada quudiya, taasoo ah dhaqan aad u caadi ah oo ku dhaca kaneecadahan5.
Sharaxaad macquul ah ayaa ah in ragga A. gambiae ay u gudbiyaan ecdysone gaar ah oo lab ah oo wax laga beddelay, kaas oo kiciya calaamad muujinaysa marinnada taranka ee dheddigga, taasoo keenta xasillooni darro isu-tagga. Si kastaba ha ahaatee, inkastoo laf-dhabarta ay leeyihiin hoormoonno badan oo steroid ah, sida estrogen iyo androgen (oo lagu eegay tixraaca 9), sida aan ognahay, steroids-ka androgenic-ka ah laguma aqoonsan cayayaanka.
Waxaan u dhaqaaqnay inaan go'aamino noocyada hoormoonada steroid ee ku jira qanjirka ragga ee labka ah (MAG) ee galmada A. gambiae oo qaangaar ah si aan u raadino steroids wax ka beddeli kara. Annagoo adeegsanayna koromatografi dareere ah oo waxqabad sare leh oo ay weheliso spectrometry mass tandem (HPLC-MS/MS) halkii aan ka ahaan lahayn habka aan gaarka ahayn ee hore loo isticmaali jiray, waxaan ku ogaanay ecdysone (E) iyo 20E unugyadan, annagoo xaqiijinayna natiijadii hore. Si kastaba ha ahaatee, muunadda waxaa ku badan steroids fosfoorasaydh oo oksaydhaysan, oo la jaanqaadaya qaacidada 3-dehydro-20E-22-phosphate (3D20E22P)12 (Jaantuska 1). Qaababka kale waxaa ka mid ah 3-dehydro-20E (3D20E) iyo 20E-22-phosphate (20E22P). Xoogga calaamadda HPLC-MS/MS ee 3D20E22P wuxuu ahaa laba amar oo cabbirkoodu ka sarreeyo qaabkeeda dephosphorylated, 3D20E, iyo saddex amar oo cabbirkoodu ka sarreeyo kan E iyo 20E (Jaantuska 1). In kasta oo qaybaha kale ee jirka iyo marinnada taranka hoose (LRT; Xogta La Fidiyay Jaantuska 1a). Waxaan sidoo kale falanqaynay ecdysteroids-ka ragga iyo dumarka cusub ee xiran (ka yar 1 maalmood) waxaana lagu ogaaday 3D20E iyo 3D20E22P oo keliya MAG; E, 20E iyo 20E22P waxay ku jireen labada jinsiba (Xogta La Fidiyay Jaantuska 1b). Xogtani waxay soo jeedinaysaa in ragga qaangaarka ah ee A. gambiae ay soo saaraan tirooyin badan oo hoormoonno wax ka beddelaya MAG-yadooda oo aan dheddiggu samayn.
MAG iyo LRT dheddig ah (oo ay ku jiraan atria, vesicles-ka seminal, iyo parovarium) ayaa laga kala qaaday ragga bikrada ah ee 4-maalmood jira (4-maalmood jira) iyo dumarka bikrada ah iyo kuwa isku jinsiga ah (0.5, 3, iyo 12 hpm). Ecdysone ee unugyadan waxaa lagu falanqeeyay HPLC-MS/MS (celcelis ahaan ± sem; baaritaanka t-ga aan la isku xirin, laba-dhinac ah, heerka daahfurka beenta ah (FDR) oo la saxay; NS, aan muhiim ahayn; *P < 0.05, **P < 0.01 . 3D20E: 3 saacadood vs. 0.5 saacadood, P = 0.035; 12 saacadood vs. 3 saacadood, P = 0.0015; 12 saacadood vs. 0.5 saacadood, P = 0.030. 3D20E22P: 3 saacadood vs. 0.5 saacadood, P = 0.25; 12 saacadood vs. 3 saacadood, P = 0.0032; 12 saacadood marka la barbar dhigo 0.5 saacadood, P = 0.015). Xogtu waxay ka timid saddex nuqul oo bayooloji ah. Meesha ugu sarreysa ee ecdyson kasta oo xiiso leh waxaa lagu xisaabiyay oo lagu caadiyeeyay tirada kaneecada. Ecdysone waxaa lagu matalaa midab sidan soo socota: E, cagaar; 20E, oranji; 20E22P, guduud; 3D20E, buluug; 3D20E22P, casaan. Qaybta hoose waxay kordhisaa miisaanka dhidibka y si loo muujiyo heerarka ecdysone ee hooseeya.
Si loo baaro in 3D20E22P iyo 3D20E la kala qaado inta lagu jiro galmada, waxaan kala qaadnay LRT-yada dheddigga waqtiyo kala duwan ka dib galmada. In kasta oo aan laga helin ecdysone bikradaha, waxaan aragnay xaddi badan oo 3D20E22P ah LRT isla markiiba ka dib galmada (0.5 saacadood ka dib galmada, hpm), taasoo hoos u dhacaysa waqti ka dib, halka heerarka 3D20E ay si weyn u kordheen (Jaantuska 1). Annagoo adeegsanayna 3D20E oo kiimiko ahaan loo sameeyay heer ahaan, waxaan go'aansannay in heerarka hoormoonkan steroid-ka ah ee isku-darka LRT-yada ay ugu yaraan 100-laab ka sarreeyaan 20E (Jadwalka Xogta ee La Fidiyay 1). Sidaa darteed, 3D20E22P waa ecdysone-ka labka ah ee ugu weyn ee loo wareejiyo LRT-ga dheddigga ah inta lagu jiro galmada, qaabkeeda fosfoorasaydhka ah, 3D20E, uu aad u badan yahay wax yar ka dib galmada. Tani waxay soo jeedinaysaa door muhiim ah oo ecdysone-ka dambe ee bayoolajiga isku-darka dheddigga.
Ka dib markii la sameeyay xog ururin cusub oo RNA ah (RNA-seq) ah (Jaantuska 2a), iyadoo la adeegsanayo dhuumaha bioinformatics-ka ee gaarka loo sameeyay, waxaan raadinay ecdysone kinase (EcK), ecdysone oxidase (EO), iyo ecdysone oo qeexaya hidde-side phosphatase oo 20E ah.EPP) waxaa lagu muujiyay unugyada taranka. Waxaan aqoonsanay hal hiddo-side EPP ah oo musharrax ah iyo laba hiddo-side ECK ah oo suurtagal ah (EcK1 iyo Eck2), laakiin ma aanan helin hiddo-side EO oo musharrax ah oo wanaagsan. Waxaa xusid mudan, hiddo-sideyaasha EPP ee shaqsiga ah waxaa lagu muujiyay heerar sare (boqolkiiba 98.9) MAG-yada Gambia laakiin ma ahayn LRT-yada dheddigga ah (Jaantuska 2b), taasoo ka soo horjeedda filashooyinkeenna tan iyo markii dephosphorylation-ka 3D20E22P uu ka dhacay unugyadan dheddigga ah. Sidaa darteed, waxaan aaminsanahay in EPP lab ah la wareejin karo inta lagu jiro isku-xidhka. Runtii, waxaan u isticmaalnay calaamadaynta isotope ee deggan in vivo si aan u qarino borotiinka dheddigga ka dib isku-xidhka, ensaym ay aqoonsatay MS ee atrium-ka dheddigga (Jaantuska 2c iyo Jadwalka Dheeraadka ah 1). Joogitaanka EPP ee MAG iyo LRT dheddig oo la isku daray (laakiin aan ahayn bikro) ayaa sidoo kale la xaqiijiyay iyadoo la adeegsanayo unugyada difaaca jirka ee gaarka ah (Jaantuska 2d).
a, Dhuumo bayoinformatics ah oo gaar loo sameeyay si loo baaro unugyada taranka ee jinsi kasta si loo helo hiddo-sideyaal qeexaya Ecks, EOs, iyo EPPs. Tirooyinka ku xiga fallaadhaha waxay muujinayaan tirada musharixiinta labka iyo dheddigga tallaabo kasta. Falanqayntani waxay aqoonsatay hal hiddo-side EPP (EPP) iyo hal hiddo-side Eck (EcK1) oo lagu muujiyey ragga, iyo hal hiddo-side Eck (EcK2) oo lagu muujiyey labada jinsi laakiin aan soo saarin hiddo-side EO musharax ah.b, Khariidadda kulaylka oo barbar dhigaysa muujinta hiddo-sideyaasha musharaxa ee bikradda (V) iyo isku-xidhka (M) Anopheles gambiae iyo unugyada Anopheles albicans.Spca, bacriminta; MAGs, qanjidhada dheeraadka ah ee ragga; Qaybaha kale ee jirka, oo ay ku jiraan naasaha, baalasha, lugaha, jidhka dufanka leh, iyo xubnaha gudaha ee labada jinsiba, iyo ugxan-sidaha dheddigga. EcK2 si weyn ayaa loogu muujiyey MAG iyo atria labadaba Gambia, halka EPP laga helo oo keliya MAG.c, falanqaynta Proteomic ee isbeddelka kooxda shahwada ragga ee loo beddelo atria dheddigga 3, 12 iyo 24 hpm, taasoo muujinaysa 67ka borotiin ee ugu badan. Dumarka waxaa lagu koriyay cunto ay ku jirto 15N si loogu calaamadeeyo (oo loo qariyo) dhammaan borotiinnada. Ragga aan calaamadda lahayn waxaa lagu lamaaneeyay dheddigga calaamadaysan, LRT-yada dheddiggana waxaa lagu kala saaray 3, 12 iyo 24 hpm si loo falanqeeyo proteomic (fiiri Jadwalka Dheeraadka ah 1 si aad u hesho liis dhammaystiran oo borotiinno shahwada ah). Inset, EPP, Eck1 iyo Eck2 waxaa lagu ogaaday MAG ragga bikrada ah iyadoo la adeegsanayo falanqaynta proteomic ee unugyadan.d, EPP waxaa lagu ogaaday western blot MAG iyo LRT ee dheddigga lammaane, laakiin laguma helin dheddigga bikrada ah ama ragga ama inta kale ee jirka dheddigga. Xuubka ayaa isku mar la baaray. oo leh anti-actin (xakamaynta rarista) iyo anti-EPP antibodies. Dhammaan ragga waa bikro. Eeg Jaantuska Dheeraadka ah 1 ee xogta isha jel. Western blots waxaa la sameeyay laba jeer iyadoo natiijooyin isku mid ah la helay.
Dhaqdhaqaaqa phosphophosphatase ee ecdysteroid ee EPP waxaa la xaqiijiyay ka dib markii la isku daray HPLC-MS/MS iyadoo la adeegsanayo 3D20E22P oo laga soocay MAG (Xogta La Fidiyay Jaantuska 2a). Intaa waxaa dheer, markii aan aamusinnay EPP iyada oo loo marayo faragelinta RNA-dhexdhexaadinta (RNAi), waxaan ogaanay hoos u dhac xooggan oo ku yimid dhaqdhaqaaqa phosphatase ee unugyada taranka ee raggan (Jaantuska 3a), dheddiggana lammaanayaasha EPP-aamusnaanta leh waxay muujiyeen muhiimad A Qayb hoose oo ka mid ah 3D20E-da oo la baabi'iyay (Jaantuska 3b) inkastoo qayb ka mid ah aamusnaanta hidde-sideyaasha (Jaantuska 2b,c). Taas bedelkeeda, ma aanan helin isbeddello muhiim ah oo ku yimid saamiga 20E22P/20E ee isla kaneecada, taas oo laga yaabo inay soo jeediso in enzyme-ku uu gaar u yahay 3D20E22P (Jaantuska 3b).
a, Hoos u dhac ku yimid dhaqdhaqaaqa fosfatase ee MAG oo ay sababtay aamusinta EPP iyadoo la adeegsanayo xakamaynta EPP RNA ee laba-laaban (dsEPP) ama GFP RNA (dsGFP) ee laba-laaban. Labaatan barkadood oo MAG ah ayaa loo isticmaalay nuqul kasta (P = 0.0046, tijaabada t-ga ee la isku daray, laba-geesood ah), oo ay matalaan dhibco kala duwan.b, Dumarka la isku daray ragga la aamusiyay EPP waxay lahaayeen saami aad u hooseeya oo ah 3D20E oo la dephosphorylated ah 3 hpm (P = 0.0043, tijaabada t-ga ee aan la isku xidhin, laba-geesood ah), halka heerarka 20E aysan saameyn ku yeelan (P = 0.063, aan la isku xidhin). Tijaabada t, laba-dhinac). Xogta waxaa lagu soo bandhigay celcelis ahaan ± sem saddex barkadood oo midkiiba ah 13, 16 iyo 19 dheddig.c, Dheddigga la galmooday ragga EPP-ka aamusan waxay lahaayeen heerar aad u sarreeya oo dib-u-galmo ah (P = 0.0002, Tijaabada saxda ah ee Fisher, laba-dhinac). Dheddigga waxaa markii hore lagu qasbay inay is-galmo si loo hubiyo xaaladdooda is-galmo; Laba maalmood ka dib, waxaa lala xiriiray rag kale oo sita shahwada transgenic si loo qiimeeyo heerarka dib-u-guurka iyadoo la ogaanayo PCR tiro ahaan ee transgene.d, dumarka dhiigga lagu quudiyo ee la nool ragga EPP-ka aamusan ayaa si weyn hoos ugu dhacay bacriminta (P < 0.0001; baaritaanka Mann-Whitney, laba-dhinac) iyo tirada ukunta oo yaraatay (P = 0.088, baaritaanka Mann-Whitney, laba-dhinac), halka heerka dhalmada uusan saameyn (P = 0.94, baaritaanka saxda ah ee Fisher, laba-dhinac). Dhammaan guddiyada, n wuxuu matalaa tirada muunadaha kaneecada ee bayooloji ahaan madaxbannaan. NS, ma aha mid muhiim ah.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001.
Marka xigta, waxaan qiimeynay in ecdysone dephosphorylation uu muhiim u yahay kicinta iska caabbinta galmada ee dheddigga. Waxaa xusid mudan in dheddigga la galmooday ragga EPP-ka ka dhammaaday ay dib ugu biireen soo noqnoqosho aad u sarreysa (44.9%) marka loo eego dheddigga la xakameeyo (10.4%) marka loo eego ragga dheeraadka ah (transgenic) (Jaantuska 3c). Waxaan sidoo kale aragnay hoos u dhac weyn oo ku yimid bacriminta (Jaantuska 3d, bidix) iyo hoos u dhac yar oo ku yimid tirada ukumaha ay dhigeen dheddiggan (Jaantuska 3d, dhexe), halka boqolleyda ukumaha ay dhigeen dheddigga (jawaab kale oo ka dhalatay dheddigga iyadoo la galmoonayo)) aan saameyn ku yeelan (Jaantuska 3d, midig). Marka la eego gaar ahaanta la arkay ee EPP ee 3D20E22P, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in kicinta 3D20E ee EPP ee la wareejiyay inta lagu jiro galmada ay yeelan karto door muhiim ah oo ku saabsan joojinta soo dhoweynta dheddigga si loo sii wado galmada, hab-dhaqan hore loogu tilmaamay gudbinta galmada ee 20E. Sidaa darteed, hoormoonkan gaarka ah ee labka ah ayaa sidoo kale si xooggan u saameeya bacriminta dheddigga.
Marka xigta, waxaan isbarbar dhignay hawlaha 20E iyo 3D20E ee tijaabooyinka duritaanka ee bikro bikro ah oo galmo ahaan loo sameeyay iyadoo la adeegsanayo 3D20E oo kiimiko ahaan loo sameeyay (Jaantuska 4a–c) iyo kuwa ganacsi ahaan loo heli karo 20E. Waxaan aragnay in 3D20E uu si weyn uga waxtar badan yahay 20E isagoo xiraya dareenka dheddigga ee isku-darka labada fiirsasho (Jaantuska 4d). Waxaa xusid mudan, kala bar heerka jir ahaaneed ee 3D20E ee LRT (1,066 pg kadib isku-darka iyo 2,022 pg kadib isku-darka) wuxuu sababay saamiga dheddigga aan adkaysan karin oo 20-laab ka sarreeya heerka jir ahaaneed ee 20E (361 pg kadib isku-darka) 24 saacadood ka dib isku-darka heerka ugu sarreeya 18 pg kadib isku-darka; Shaxda Xogta ee La Dheereeyay 1). Natiijadani waxay la jaanqaadaysaa fikradda ah in gudbinta galmada ee 20E aysan sababin muddooyin aan la isku galmoon karin, waxayna sidoo kale tilmaamaysaa 3D20E inay tahay arrin muhiim ah oo lagu hubinayo xiriirka waalidka iyo ilmaha. 3D20E sidoo kale waxay si weyn uga firfircoonayd 20E baaritaannada ukunta ee dheddigga bikrada ah (Jaantuska 4e), taasoo soo jeedinaysa in heerka ukunta ee caadiga ah ee aan aragnay ka dib markii qayb ka mid ah aamusnaanta EPP ay sabab u ahayd joogitaanka dhaqdhaqaaqa 3D20E ee harsan oo wali ay soo saaraan arrimaha dheddigga ee ay keento lamaanaha.
(a,b) 3D20E oo si kiimiko ah looga sameeyay 20E (a) oo leh beddel/hufnaan aad u sarreysa (xogta lagu soo bandhigay celcelis ahaan ± sem ka timid saddex falgallo isku-darka madaxbannaan) (b).c, Kala-soocidda cufnaanta (qaybta hoose) waxay si sax ah ula mid tahay ecdysone laga helay LRT dheddig oo la isku daray (qaybta sare).d, Marka la barbar dhigo 20E (0.63 µg, P = 0.02; 0.21 µg, P < 0.0001; Tijaabada saxda ah ee Fisher, laba-dhinac) iyo 10% ethanol (0.63 µg, P < 0.0001; 0.21 µg, P < 0.0001; Tijaabada saxda ah ee Fisher, 2-dhinac), halka 20E ay si weyn uga sarreeysay xakamaynta oo keliya qiyaaso sare (0.63 µg, P = 0.0002; 0.21 µg, P = 0.54; Saxda Fisher tijaabo, 2-dhinac).e, duritaanka 3D20E wuxuu sababay heerarka dhalmada oo aad uga sarreeya dumarka bikrada ah marka loo eego 10% xakamaynta ethanol (0.21 µg, P < 0.0001; 0.13 µg, P = 0.0003; Tijaabada saxda ah ee Fisher, laba-dhinac), halka 20E marka la barbar dhigo xakamaynta Kaliya qiyaaso sare (0.21 µg, P = 0.022; 0.13 µg, P = 0.0823; Tijaabada saxda ah ee Fisher, laba-dhinac). 3D20E waxay keentay heerarka dhalmada oo aad uga sarreeya 20E qiyaaso sare (0.21 µg, P = 0.0019; 0.13 µg, P = 0.075; Tijaabada saxda ah ee Fisher, laba-dhinac). Dhammaan guddiyada, n waxay u taagan tahay tirada muunadaha kaneecada ee bayooloji ahaan madaxbannaan. NS, ma aha mid muhiim ah.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.001. Xogtu waxay ka timid saddex nuqul.
Daraasado hore, waxaan ku ogaanay in gudbinta galmada ee hoormoonada steroid ay kiciso muujinta MISO (Qalabka kicinta ee lammaane ee Oogenesis 11), hiddo-wadaha taranka dheddigga ah ee ka ilaaliya dheddigga A. gambiae caabuqa P. falciparum Kharashyada caafimaadka ee ay sababaan 13, oo ah dulin-duureedka ugu dhimashada badan ee duumada aadanaha. Iyadoo la tixgelinayo muhiimadda MISO u leedahay taam ahaanshaha taranka ee Anopheles ee meelaha duumada ku badan tahay, waxaan go'aansannay inaan go'aamino hoormoonka 3D20E ama 20E ee kiciya muujinta hidda-wadaha. Waxaan ogaanay in halka duritaanka 20E uu si gaar ah ama si ka xoog badan u kiciyay qaar ka mid ah soo-dhoweeyayaasha hoormoonka nukliyeerka (HR), sida HR3 iyo HR4, iyo bartilmaameedyada steroid-ka ee caadiga ah, sida hiddo-wadaha yolkogenic Vg14, 15, 16, MISO waxaa si xoog leh u kiciyay 3D20E (Xogta La Fidiyay Jaantuska 3). Sidaa darteed, wareejinta galmada ee hoormoonkan steroid-ka androgenic wuxuu u muuqdaa inuu kicinayo habab ka ilaaliya dheddigga kharashyada uu keeno caabuqa dulinka. Intaa waxaa dheer, 3D20E si kala duwan ayuu u saameeyaa labada nooc ee kala duwan ee E receptor EcR, oo kicinaysa EcR-A iyo caburinta EcR-B, iyo si xooggan u kicinaysa hiddo-sideyaal kale oo keena isku-xidhka, oo ay ku jiraan HPX15, oo saameeya bacriminta dheddigga. Tani waxay sharxi kartaa dhalmo la'aanta muhiimka ah ee lagu arkay dheddigga lammaanayaasha EPP-ka aamusan (Xogta La Fidiyay Jaantuska 3). Xogtani waxay soo jeedinaysaa jiritaanka dariiqyo hoose oo ay doorbidaan inay ka shaqeeyaan laba hoormoon oo ecdysone ah kuwaas oo laga yaabo inay saldhig u noqdaan shaqada gaarka ah ee jinsiga.
Marka xigta, waxaan tijaabinay shaqada labada hiddo-side ee Eck ee lagu aqoonsaday dhuumahayaga bioinformatics. Aamusnaanta EcK1 ama EcK2 waxay keentay dhimasho muhiim ah oo ku dhacda ragga (Sawirka Xogta La Fidiyay 4a), taasoo soo jeedinaysa in fosfoorasaydhka ecdysone, sidaas darteedna aan firfircoonayn, uu muhiim u yahay badbaadada. Sababtoo ah EcK2 waxaa lagu muujiyay heerar ka sarreeya EcK1 waxaana lagu ogaaday MAGs-ka proteomics (Sawirka 2b,c iyo Shaxda Dheeraadka ah 2), waxaan xaqiijinay dhaqdhaqaaqiisa ecdysteroid kinase annagoo ku dhex milmayna 20E, taasoo keentay fosfoorasaylka 20E22P (Sawirka Xogta La Fidiyay 2).4b). Markii aan u isticmaalnay 3D20E substrate ahaan, ma aanan awoodin inaan ogaano badeecada fosfoorasaylka 3D20E22P (Sawirka Xogta La Fidiyay 4c), taasoo soo jeedinaysa in 20E halkii laga isticmaali lahaa 3D20E ay noqon karto bartilmaameedka la doorbidayo ee Eck2.
Sida laga soo xigtay falanqaynteena RNA-seq, Eck2 sidoo kale si weyn ayaa loogu muujiyay LRT-ga dheddigga bikrada ah, halkaas oo laga damiyay ka dib markii la isku galmooday (Jaantuska 2b). Waxaan xaqiijinay xogtan waxaanan go'aaminay in muujinta Eck2 aysan saameyn ku yeelan quudinta dhiigga (Jaantuska Xogta La Fidiyay 5a). Kordhinta tijaabooyinkayadii hore ee MS, waxaan go'aaminay in ugu sarreysa 20E22P ay si dhow ula xiriirto ugu sarreysa 20E (22-26 saacadood ka dib cuntada dhiigga; Xogta La Fidiyay Jaantuska 5b). Aamusnaanta Eck2 ee dheddigga bikrada ah waxay keentay koror 3-laab ah oo ku yimid saamiga qaraabada ah ee 20E ilaa 20E22P 26 saacadood ka dib cuntada dhiigga (Jaantusyada Xogta La Fidiyay 2c iyo 5c), taasoo xaqiijinaysa in Eck2 sidoo kale fosfoorasaytyo 20E ee dheddigga. Waxaa xusid mudan, bikradaha Eck2 ee la baabi'iyay waxay ilaalinayeen soo dhawayn galmo oo buuxda (Xogta La Fidiyay Jaantuska 5d,e), iyadoo sii jeedinaysa in wax soo saarka dheddigga ee 20E uusan kicin muddooyin aan la isku galmoonayn. Si kastaba ha ahaatee, kuwan Dumarku waxay si weyn u kordhiyeen heerarka ukunta marka la barbar dhigo kuwa la xakameeyay, iyadoo in ka badan 30% bikro ah ay ukunta dhigayaan (Sawirka Xogta La Fidiyay 5f). Haddii irbadaha Eck2 RNA (dsEcK2) ee laba-laaban la sameeyay ka dib quudinta dhiigga, dhalmo ma dhicin, waqtigaas oo heerka ugu sarreeya ee 20E uu hoos u dhacay sababtoo ah nuugista dhiigga. Guud ahaan, natiijooyinkani waxay taageeraan qaab ah in 20E la soo saaro ka dib nuugista dhiigga uu kicin karo dhalmo, laakiin kaliya marka xannibaadda dhalmo (EcK2 iyo suurtogalnimada arrimo kale) la damiyo iyadoo la isku galmoodo. Midkoodna irbadaha 20E iyo 3D20E ma aysan joojin muujinta Eck2 ee bikro (Xogta La Fidiyay Jaantuska 5g), taasoo soo jeedinaysa in arrimo kale ay dhexdhexaadinayaan joojinta kinase-kan. Si kastaba ha ahaatee, heerarka 20E ka dib quudinta dhiigga kuma filna inay kiciyaan raaxo-darrada lammaanenimada, laakiin waxaa si wax ku ool ah u kiciyay tirooyinka sare ee 3D20E ee galmada lagu gudbiyo.
Natiijooyinkayagu waxay bixiyaan aragtiyo muhiim ah oo ku saabsan hababka nidaaminaya guusha taranka ee A. gambiae. Qaab ayaa soo baxay halkaas oo raggu ay u horumareen inay sameeyaan tirooyin sare oo ah 3D20E, ecdysone lab ah oo wax laga beddelay oo hubiya waalidnimada iyadoo ka dhigaysa dheddigga mid aan dareen lahayn si ay u sii wataan galmada. Isla mar ahaantaana, walxahan duumada ayaa sidoo kale horumariyay nidaam wax ku ool ah si loo kiciyo 3D20E ee dheddigga iyadoo laga jawaabayo gudbinta galmada ee EPP-ga lab-gaar ah. Inta aan ognahay, tani waa tusaalaha ugu horreeya ee nidaamka hoormoonka steroid-ka ee ragga iyo dumarka ay ku badan yihiin oo fulinaya shaqo gaar ah oo muhiim ah cayayaanka. Shaqada ecdysone-ka ee ragga gaarka ah ayaa la soo bandhigay laakiin si cad looma muujin. Tusaale ahaan, mala-awaal badan oo la beeniyay 18 ayaa ah in hawlahan ay qaban karaan horudhaca 20E E1. Waa la ogyahay in Drosophila, monandry waxaa kiciya wareejinta galmada ee peptides-ka galmada yar19,20 kuwaas oo la falgala neerfayaasha oo ku dhex milma marinnada taranka dheddigga iyada oo loo marayo soo-dhoweeyayaasha peptide-ka galmada gaarka ah21,22. Shaqo dheeraad ah ayaa loo baahan yahay si loo go'aamiyo calaamadaynta hoose. cascades oo ay maamusho 3D20E dheddigga A. gambiae iyo in la go'aamiyo in cascades-yadan la ilaalin karo inta u dhaxaysa kaneecada iyo Drosophila.
Marka la eego doorka muhiimka ah ee 3D20E ee bacriminta dheddigga iyo dhaqanka lagu aqoonsaday daraasaddeenna, waddooyinka u horseeda isku-darka iyo kicinta 3D20E waxay bixiyaan fursado cusub oo loogu talagalay istaraatiijiyadaha xakamaynta kaneecada mustaqbalka, sida jiilka ragga ee tartanka leh ee nadiifka ah ee xeeladaha tignoolajiyada cayayaanka ee nadiifka ah U isticmaal sii deynta duurjoogta ah ama si ay ugu daydaan 3D20E ee ciyaarta bikradda ah. Hawsha gaarka ah ee ragga ee 3D20E ayaa laga yaabaa inay horumartay markii A. gambiae iyo noocyada kale ee Cellia ay heleen awoodda ay ku xidhaan shahwadooda baloogyada isku-xidhka, maadaama tani ay u oggolaanayso wareejinta hufan ee tiro badan oo hoormoonno ah iyo enzymes-ka firfircoon ee hoormoonka. Dhanka kale, horumarinta 3D20E ee hirgelinta monandry waxay siisaa hab dumarka (iyada oo loo marayo muujinta sare ee MISO) si ay u doorbidaan jirkooda taranka meelaha ay ku badan tahay duumada, taas oo si dadban uga qayb qaadata gudbinta Plasmodium. Iyadoo la tixgelinayo in dheddigga 20E la muujiyay inay saameyn qoto dheer ku leedahay badbaadada iyo koritaanka P. falciparum ee kaneecada dheddigga ah ee Anopheles, 24 labadaba waddooyinka hoormoonka steroid-ka ee labka iyo dheddigga ayaa hadda ah dhinacyada muhiimka ah ee isdhexgalka kaneecada-dulinka.
Noocyada G3 ee gambiae waxaa lagu koriyay xaaladaha cayayaanka caadiga ah (26-28 °C, 65-80% qoyaan qaraabo ah, 12:12 saacadood oo iftiin/madow ah). Dirxiga waxaa lagu quudiyay cunto kalluun budo ah (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets iyo Tetra Pond Sticks oo ah saamiga 7:7:2). Kaneecada dadka waaweyn waxaa la siiyay xal 10% dextrose ah iyo dhiigga aadanaha ee toddobaadlaha ah (daraasad qaybaha dhiigga). Kaneecada bikrada ah waxaa la helay iyadoo la kala saarayo jinsiga marxaladda ilmaha ka dib markii la baaray dhammaadka iyadoo la adeegsanayo mikroskoob. Ragga sita hiddo-wadaha DsRed ayaa hore loogu sharraxay.
Tijaabooyin isku-xidhka qasabka ah ayaa la sameeyay iyadoo la raacayo hab-raacyada hore loo sharraxay. Isku-xidhka dabiiciga ah, dumarka bikrada ah ee 4-maalmood jira waxaa lagu hayay saamiga 1:3 ee ragga bikrada ah ee galmada ku soo koraya laba habeen. Tijaabooyin lagu duray ragga dsEPP, isku-xidhka isku-xidhka wuxuu la mid ahaa maalmo 3-4 ka dib duritaanka, markii dhaqdhaqaaqa fosfatase si weyn loo aamusiyay (Xogta La Fidiyay Jaantuska 2b).
Unugyada kaneecada, meydadka haray (inta kale ee jirka), ama jirka oo dhan ayaa loo kala qaybiyay 100% methanol waxaana lagu sameeyay isku-dhafan oo leh ul (2 mm galaas oo kuul ah, 2,400 rpm, 90 ilbiriqsi). Tirada unugyada iyo mugga methanol waxay ahaayeen sidan soo socota: inta kale ee jirka, 50 gudaha 1,000 µl; MAG, 50–100 80 µl; LRT dheddig, 25–50 80 µl. Qulqulka waxaa lagu sameeyay soo saarid methanol labaad oo leh isla mugga methanol. Qashinka unugyada waxaa laga saaray centrifugation. Methanol-ka laga soo saaray labada soo saarid ayaa la isku daray oo la qalajiyey iyadoo la raacayo socodka nitrogen, ka dibna dib loogu celiyey mugga soo socda ee 80% methanol biyaha: inta kale ee jirka, 50 µl; MAGs iyo LRT dheddig, 30 µl.
Shaybaarrada waxaa lagu falanqeeyay cabbire cuf (ID-X, Thermo Fisher) oo lagu xiray qalab LC ah (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl oo muunad ah ayaa lagu duray tiir 3 µm, 100 × 4.6 mm ah (Inspire C8, Dikma) oo lagu hayay 25 °C. Marxaladaha guurguura ee LC waxay ahaayeen A (biyo, 0.1% formic acid) iyo B (acetonitrile, 0.1% formic acid). Jaangooynta LC waxay ahayd sidan soo socota: 5% B muddo 1 daqiiqo ah, ka dibna loo kordhiyay 100% B muddo 11 daqiiqo ah. Ka dib 8 daqiiqo oo ah 100%, dib u dheellitir tiirka 5% B muddo 4 daqiiqo ah. Heerka socodka wuxuu ahaa 0.3 ml min-1. Ionization-ka isha MS waxaa lagu gaaraa ionization-ka korantada ee kulul ee qaababka togan iyo kuwa taban.
Cabbiraha cufnaanta ayaa cabbira xogta ku jirta m/z laga bilaabo 350 ilaa 680 oo leh xallin 60,000 ah oo qaab MS oo buuxa ah. Xogta MS/MS waxaa laga helay [M + H]+ (dhammaan bartilmaameedyada), [M - H2O + H]+ (dhammaan bartilmaameedyada), iyo [M - H]- (bartilmaameedyada fosfoorasaytka leh). Xogta MS/MS waxaa loo isticmaalay in lagu xaqiijiyo sifooyinka ecdysone ee bartilmaameedyada aan loo hayn heer. Si loo aqoonsado ecdysteroids aan la beegsan, xogta MS/MS ee dhammaan meelaha ugu sarreeya HPLC ee leh >15% tiro qaraabo ah ayaa la falanqeeyay. Cabbir adoo isticmaalaya qaloocyada caadiga ah ee laga sameeyay heerarka saafiga ah (20E, 3D20E) si loo xisaabiyo xaddi dhammaystiran ama kala-goyn hal muunad gaar ah (dhammaan bartilmaameedyada kale) si loo xisaabiyo u-dhigmadooda qaddarka laga helay hal lab. 3D20E, qiyaasidda waxaa lagu sameeyay iyadoo la isticmaalayo wadarta isku-darka soo socda: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Xogta waxaa laga soo saaray oo lagu qiyaasay iyadoo la adeegsanayo Tracefinder (nooca 4.1). Xogta MS/MS waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo Xcalibur (nooca 4.4). Muuqaallada MS ee E, 20E iyo 3D20E waxaa la barbar dhigay heerarka u dhigma. 3D20E22P waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo fal-celinta Girard. 20E22P waxaa lagu falanqeeyay saamiga m/z.
3D20E22P waxaa laga nadiifiyay MAG. Nadiifinta waxaa lagu sameeyay miisaan falanqayn ah iyadoo la adeegsanayo chromatograph dareere ah oo aad u-waxqabad leh (Acquity, Waters) oo leh qalab lagu ogaanayo cufnaanta quadrupole (QDa, Acquity, Waters) oo hoos yimaada xaaladaha LC ee la midka ah falanqaynta HPLC-MS/MS. Ururinta jajabka ayaa la kiciyay markii m/z oo u dhiganta 3D20E22P la ogaaday isla waqtiga haynta sidii hore loo go'aamiyay. Nadiifnimada isku-dhafka la soo saaray waxaa markaa hubiyey HPLC-MS/MS sida kor lagu sharaxay.
Wadarta RNA waxaa laga soo saaray 10-12 unugyo taranka ah ama qaybo kale oo jirka ah (madax la'aan) iyadoo la adeegsanayo TRI reagent (Thermo Fisher) iyadoo la raacayo tilmaamaha soo saaraha. RNA waxaa lagu daaweeyay TURBO DNase (Thermo Fisher). cDNA waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (M-MLV RT; Thermo Fisher) iyadoo la raacayo tilmaamaha soo saaraha. Astaamaha PCR-ka ee dib-u-qorista tirada (RT-qPCR; Jadwalka Xogta ee La Kordhiyay 2) ayaa hore loo daabacay 24 ama loogu talagalay iyadoo la adeegsanayo Primer-BLAST26, iyadoo la doorbidayo alaabada 70-150 bp ee cabbirka iyo isgoysyada exon-exon ee ballaaran ama Primer pair primers exons oo gooni ah. Shaybaarada cDNA laga soo bilaabo saddex ilaa afar nuqul oo bayooloji ah ayaa lagu qasi jiray afar laab biyo RT-qPCR. Tirada waxaa lagu sameeyay falcelinno ku celcelin ah oo 15 µl ah oo ka kooban 1 × PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers, iyo 5 µl oo cDNA la qasi jiray. Falcelinta waxaa lagu socodsiiyay Nidaamka PCR-ka ee waqtiga-dhabta ah ee QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) iyo xogta ayaa la ururiyay oo la falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo Naqshadeynta iyo Falanqaynta (nooca 2.4.3). Sida lagu muujiyay daraasaddan, qaddarka qaraabada ah ayaa caadi loo dhigay hidda-wadaha ribosomal RpL19 (AGAP004422), kaas oo muuqaalkiisu aanu si weyn isu beddelin quudinta dhiigga 27 ama isku-xidhka 3.
Tayada RNA waxaa lagu hubiyay iyadoo la adeegsanayo Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Maktabadaha isku-dhafka ah ee Illumina ayaa la diyaariyey oo lagu maamulay Machadka Broad ee MIT iyo Harvard. Akhrinta taxanaha ah waxaa lagu habeeyay genome-ka A. gambiae (nooca PEST, nooca 4.12) iyadoo la adeegsanayo HISAT2 (nooca 2.0.5) oo leh xuduudaha caadiga ah. Akhrinta leh tayada khariidaynta (MAPQ) dhibcaha <30 ayaa laga saaray iyadoo la isticmaalayo Samtools (nooca 1.3.1). Tirada akhrinta loo sawiray hiddo-wadaha waxaa lagu tiriyay iyadoo la isticmaalayo tirinta htseq (nooca 0.9.1) oo leh xuduudaha caadiga ah. Tirooyinka akhriska ee caadiga ah ayaa la xisaabiyay waxaana la falanqeeyay muujinta hidda-wadaha kala duwan iyadoo la adeegsanayo xirmada DESeq2 (nooca 1.28.1) ee R (nooca 4.0.3).
Musharixiinta hidda-wadaha ee wax ka beddelaya Ecdysone waxaa lagu aqoonsaday markii ugu horreysay iyadoo la baarayo hidda-wadaha A. gambiae iyadoo la adeegsanayo algorithm-ka PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), iyadoo la adeegsanayo qiimayaasha caadiga ah. Cabbirrada leh taxanaha borotiinka su'aasha soo socota: laga bilaabo Bombyx mori (Helitaanka No. NP_001038956.1), Musca domestica (Helitaanka No. XP_005182020.1, XP_005175332.1 iyo XP_011294434.1) iyo Microplitus demolitor (Helitaanka No. XP_008552646.1 iyo XP_008552645.1) Eck laga bilaabo B. mori (Helitaanka No. NP_001036900), Drosophila melanogaster (Helitaanka No. NP_651202), Apis mellifera (Xigasho Lambarka XP_394838) iyo Acyrthosiphon pisum (Xigasho Lambarka XP_001947166); iyo EPP laga bilaabo B. mori (Xigasho Lambarka XP_001947166) NP_001177919.1 iyo NP_001243996.1) iyo EO ee D. melanogaster (Xigasho Lambarka NP_572986.1) (tallaabada 1). Marka xigta, shaandhaynta ayaa ku dhacda iyadoo lagu saleynayo muujinta mRNA sare (>100 jajab/kilobase exons halkii milyan ee akhrinta la sawiray (FPKM) ama >85%) ee unugyada taranka (LRT ama MAG dheddig) ee Gambia (tallaabada 2). Si loo hagaajiyo gaar ahaanshaha, waxaan dooranay ensaymyada musharixiinta ah ee sidoo kale lagu muujiyo unugyada taranka ee A. albimanus, oo ah nooc anopheles ah oo aan isku darin ama aan gudbin ecdysone inta lagu jiro isku darka. Hidde-sidayaasha musharixiinta waxaa lagu sifeeyay iyadoo lagu saleynayo muujinta hoose (<100 FPKM ama <85aad boqolkiiba) ee unugyada taranka ee A. albimanus (tallaabada 3). Sida shaandhaynta kama dambaysta ah (tallaabada 4), hiddo-sidayaasha musharixiinta ah waxay u baahan yihiin inay qanciyaan ugu yaraan mid ka mid ah kuwan soo socda: (1) si weyn loo hagaajiyay ka dib isku darka (P < 0.05) sida ku cad falanqaynta hiddo-sidayaasha si kala duwan loo muujiyey iyo (2) unugyada aan taranka ahayn (< 85% ama <100 FPKM).
Waxaan wax ka beddelnay hababkii hore loo sharraxay 28,29,30 si loo gaaro calaamadaynta isotopic-ga noolaha oo dhan. Si kooban, nooca duurjoogta ah ee Saccharomyces cerevisiae nooca II (YSC2, Sigma) waxaa lagu tijaabiyay saldhigga nitrogen-ka khamiirka (BD Difco, DF0335) oo ka kooban (wt/vol) 2% gulukoos (G7528, Sigma), 1.7% amino acid-free iyo ammonium sulfate. dhexdhexaadka dhaqanka) iyo 5% 15N ammonium sulfate (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) oo ah isha kaliya ee nitrogen. Khamiirka waxaa lagu soo celiyay centrifugation dirxiga kaneecadana waxaa la quudiyay ad libitum ilaa ay ka soo baxaan. Ku darista kalluunka (0.5 mg 300 dirxi kasta) si looga hortago dhimashada afaraad ee dhalashada. Kaliya dumarka ayaa markaa loo isticmaalay tijaabooyinka isku-xidhka ee labka aan calaamadda lahayn si loo falanqeeyo borotiinka labka ah ee la wareejiyay inta lagu jiro isku-xidhka.
Dumarka bikrada ah ee 4-6 maalmood jirka ah ee lagu calaamadeeyay 15N ayaa lagu qasbay inay la galmoodaan ragga bikrada ah ee aan lahayn calaamad da'da. Isku-xidhka guuleysta waxaa lagu xaqiijiyay iyadoo la ogaanayo xirmooyinka isku-xidhka iyadoo la adeegsanayo mikroskoobka epifluorescence. 3, 12, iyo 24 hpm, atria-ga 45-55 dheddig ee isku-xidhka ah ayaa lagu kala qaybiyay 50 µl oo ah ammonium bicarbonate buffer (pH 7.8) waxaana lagu daray pestle. Isku-xidhka waxaa la centrifuged ka dibna waxa uu ka sarreeyaa waxaa lagu qasay 50 µl oo ah 0.1% RapiGest (186001860, Waters) oo ku jira 50 mM ammonium bicarbonate. Dusha sare iyo pellet-ka laga soo qaaday muunad kasta waxaa lagu qaboojiyey baraf qalalan waxaana loo diray habeenkii shaybaadhka MacCoss ee Jaamacadda Washington, halkaas oo lagu dhammaystiray diyaarinta muunadda LC-MS/MS. Dib ugu celi pellet-ka 50 µl oo ah 0.1% RapiGest oo ku jira 50 mM ammonium bicarbonate iyo sonicate qubeys biyo ah. Fiirsashada borotiinka ee pellet-ka iyo supernatant-ka waxaa lagu cabiray tijaabada BCA, muunado ayaa lagu yareeyay 5 mM dithiothreitol (DTT; Sigma), alkylated oo leh 15 mM iodoacetamide (Sigma) oo lagu kululeeyay 37 °C (1:0 50) muddo 1 saac ah iyadoo la adeegsanayo trypsinization: trypsin: saamiga substrate).RapiGest waxaa lagu lysed iyadoo lagu daray 200 mM HCl, ka dibna lagu kululeeyay 37 °C muddo 45 daqiiqo ah iyo centrifugation 14,000 rpm muddo 10 daqiiqo ah 4 °C si looga saaro qashinka. Muunado waxaa lagu dhaqay soo saarista laba-qaab oo adag (kartiyada Oasis MCX, Biyaha) waxaana dib loogu celiyey 0.1% formic acid si loo helo uruurinta borotiinka ugu dambeysa ee 0.33 µg µl-1. Proteomes-ka aan calaamadda lahayn ee MAG ayaa si la mid ah looga falanqeeyay ragga bikrada ah. Laba Tijaabooyinka falanqaynta ayaa lagu falanqeeyay muunad kasta. Marka xigta, 1 µg midkiiba waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la isticmaalayo tiir 25-cm ah oo silica ah oo 75-μm ah oo leh dabin frit ah oo 4-cm ah oo silica ah oo lagu daray resin-ka Jupiter C12 ee dib loo rogay (Phenomenex) iyo koromagrafi dareere ah oo 180-daqiiqo ah. Qaybaha muunadaha - MS/MS waxaa lagu socodsiiyay Q-Exactive HF mass spectrometer (Thermo Fisher) oo leh nanoACQUITY UPLC System (Waters). Xogta helitaanka xogta ee la xiriirta socod kasta waxaa loo beddelay qaab mzML iyadoo la adeegsanayo Proteowizard (nooca 3.0.20287) iyo iyadoo la adeegsanayo Comet31 (nooca 3.2) oo ka dhan ah xogta FASTA oo ka kooban taxane borotiin ah oo ka yimid Anopheles gambiae (nooca VectorBase 54), Anopheles coluzzi Baaritaan ayaa lagu sameeyay Mali-NIH (nooca VectorBase 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, Maarso 2021), A. gambiae RNA-seq, iyo turjumaad saddex-qaab ah oo ah wasakhowga aadanaha ee la yaqaan. FDR-yada khariidadda la jaanqaadaya Peptide waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la adeegsanayo Percolator32 (nooca 3.05) oo leh heer 0.01, peptide-yadana waxaa lagu soo ururiyey aqoonsi borotiin iyadoo la adeegsanayo parsimony borotiin ah oo ku jira Limelight33 (nooca 2.2.0). Tirada borotiinka ee qaraabada ah waxaa lagu qiyaasay iyadoo la adeegsanayo qodobka tirada badan ee spectral-ka caadiga ah (NSAF) oo loo xisaabiyay borotiin kasta oo ku jira marxalad kasta sida hore loogu sharraxay. NSAF marka loo eego borotiin kasta waxaa lagu celcelisay muunado laga soo qaatay laba nuqul oo bayooloji ah oo kala duwan. Calaamadaynta 15N si guul leh ayay u qarisay borotiinka dheddigga, inkastoo tiro yar oo borotiin aan calaamad lahayn laga heli karo bikradaha calaamadaysan. Waxaan diiwaangelinay ogaanshaha dhimista borotiinka ragga (1-5 spectra) muunado cayriin ah oo dheddig ah oo keliya marxalado farsamo, halkaas oo muunado cayriin ah lagu sameeyay ka dib muunado lab/lab ah, taasoo ka dhalatay HPLC oo "qaaday". Marmar borotiinnada laga helo 'wasakh' oo ka yimid bikradaha calaamadaysan waxaa lagu taxay Jadwalka Dheeraadka ah 1.
Laba peptide oo antigenic ah, QTTDRVAPAPDQQQ (gudaha isotype PA) iyo MESDGTTPSGDSEQ (gudaha isotype PA iyo PB) ee Genscript. Labada peptide waa la isku daray, ka dibna waxaa lagu daray borotiinka side KLH waxaana lagu duray bakaylaha New Zealand. Bakaylaha waxaa la qalay ka dib markii la duray afraad, wadarta IgG-gana waxaa lagu go'doomiyay nadiifinta isku-dhafka ah. IgG laga soo qaaday bakaylaha ugu badan ee EPP-ga ayaa loo isticmaalay in lagu sii daayo galbeedka.
Xuubka galbeed, MAG (n = 10, halkaas oo n uu matalo tirada muunadaha kaneecada ee bayooloji ahaan madaxbannaan) iyo LRT dheddig ah (n = 30) oo ka yimid ragga bikrada ah ee 4-maalmood jira iyo dumarka bikrada ah ama kuwa lagu qasbay (<10 kadib isu-tagga), kaydka soo saarista borotiinka (50 mM Tris, pH 8.0; 1% NP-40; 0.25% sodium deoxycholate; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1 × protease inhibitor cocktail (Roche)) ayaa si gaar ah loogu daray. Muunado ayaa isla markiiba la isku daray ka dib markii la kala jaray iyadoo la isticmaalayo ul (2 mm galaas oo kuul ah, 2,400 rpm, 90 ilbiriqsi). Qashinka aan milmin waxaa laga saaray centrifugation 20,000 g heerkul ah 4 °C. Borotiinnada waxaa lagu qiyaasay baaritaanka Bradford (Bio-Rad). Kadib, 20 µg oo borotiin MAG ah, 40 µg oo borotiin LRT ah, iyo 20 µg oo borotiin ah Borotiinka haraaga ah ee dufanka badan ayaa la jarjaray oo lagu kala saaray 10% Bis-Tris NuPAGE iyadoo la adeegsanayo MOPS buffer. Borotiinnada waxaa loo wareejiyay xuubka polyvinylidene fluoride iyadoo la adeegsanayo nidaamka wareejinta iBlot2 (Thermo Fisher). Xuubabka waxaa laba jeer lagu dhaqay 1 × PBS-T (0.1% Tween-20 ee PBS) ka dibna lagu xiray Odyssey block buffer (Li-Cor) muddo 1 saac ah 22°C. Xuubabka waxaa la ruxay habeenkii 4 °C iyadoo la adeegsanayo antibody-ga caadiga ah ee anti-EPP polyclonal primary antibody (1:700 ee block buffer) iyo antibody-ga monoclonal primary monoclonal monoclonal ee jiirka anti-actin MAC237 (Abeam; 1:4,000). Xuubabka waxaa lagu dhaqay PBS-T ka dibna waxaa lagu dhex daray antibody-yada labaad (dameerka anti-bakaylaha 800CW iyo riyaha anti-jiirka 680LT (Li-Cor), labadaba 1:20,000) oo ku jira block buffer oo ay ku jiraan 0.01% SDS iyo 0.2% Tween -20 muddo 1 saac ah heerkul ah 22 °C. Xuubka waxaa lagu dhaqay PBS-T waxaana lagu sawiray iskaanka Odyssey CLx. Sawirrada waxaa lagu soo ururiyay oo lagu farsameeyay Image Studio (nooca 5.2). Xarig gaar ah oo u dhigma isoform-ka EPP-RA (82 kDa) lama helin.
Gobollada codaynta ee EPP (sida isoform AGAP002463-RB oo ka kooban domainka histidine phosphatase, NCBI conserved domain search 34) iyo Eck2 (AGAP002181) ayaa loo sameeyay pET-21a(+) plasmid (Novagen Millipore Sigma); astaamayaasha waxaa lagu taxay Shaxda Xogta La Fidiyay 2. Siddeed xiriiriye oo GS4 ah (oo isku dhafan) ayaa la geliyay ka hor calaamadda C-terminal 6xHis ee dhismaha pET-21a(+)-EcK2. Borotiinnada dib loo isku daray waxaa la soo saaray iyadoo la adeegsanayo falgalka isku-darka borotiinka E. coli ee aan unugyada lahayn ee NEBExpress (New England BioLabs). Borotiinnada dib loo isku daray waxaa lagu nadiifiyay iyadoo la isticmaalayo tiirarka wareegga NEBExpress Ni (New England BioLabs). Borotiinnada xakamaynta Dihydrofolate reductase (DHFR) waxaa la soo saaray iyadoo la adeegsanayo shaxanka DNA-da ee laga helay Qalabka Isku-darka Borotiinnada ee NEBExpress ee aan Unugyada lahayn ee E. coli. Borotiinnada waxaa lagu kaydiyay 50% glycerol PBS -20 °C ilaa 3 bilood.
Waxqabadka fosfatase ee EPP iyo soosaarka unugyada waxaa lagu cabiray iyadoo la adeegsanayo 4-nitrophenyl phosphate (pNPP; Sigma-Aldrich). Kaydka falcelinta wuxuu ka koobnaa 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, iyo 1 mM DTT. Unugga ayaa lagu sameeyay isku-dhafan kaydka falcelinta waxaana qashinka unugyada laga saaray centrifugation. Bilow falcelinta adigoo ku daraya enzyme ama soosaar unug kaydka falcelinta oo ka kooban 2.5 mg ml-1 pNPP. Isku darka falcelinta waxaa lagu kululeeyay heerkulka qolka mugdiga ah, xaddiga pNP ee laga beddelay pNPP waxaa lagu cabbiray iyadoo la cabbirayo nuugista 405 nm waqtiyo kala duwan.
Hawlaha Eck-ga ee In Vitro, borotiinka waxaa lagu kululeeyay 0.2 mg 20E ama 3D20E oo ku jira 200 µl buffer (pH 7.5) oo ka kooban 10 mM HEPES–NaOH, 0.1% BSA, 2 mM ATP iyo 10 mM MgCl2 muddo 2 saacadood ah heerkul ah 27 °C. Falcelinta waxaa la joojiyay iyadoo lagu daray 800 µl methanol, ka dibna lagu qaboojiyay -20 °C muddo 1 saac ah, ka dibna lagu centrifugeeeyay 20,000 g muddo 10 daqiiqo ah heerkul ah 4 °C. Dabadeed waxaa falanqeeyay HPLC-MS/MS. Si loo kululeeyo-joojinta borotiinnada loo isticmaalo kooxda xakamaynta, borotiinnada waxaa lagu kululeeyay 50% glycerol PBS muddo 20 daqiiqo ah heerkul ah 95 °C.
Hawlaha EPP ee In Vitro, borotiinka waxaa lagu dhex daray 3D20E22P (oo u dhiganta xaddiga laga helay 18 lammaane oo MAG ah, oo lagu nadiifiyay HPLC-MS/MS) oo ku jira 100 µl buffer (pH 7.5) oo ka kooban 25 mM Tris, 50 mM acetic acid, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, iyo 1 mM DTT muddo 3 saacadood ah heerkul ah 27 °C. Falcelinta waxaa la joojiyay iyadoo lagu daray 400 µl methanol waxaana lagu qaboojiyay -20 °C muddo 1 saac ah, ka dibna lagu dhex geliyay 20,000 g muddo 10 daqiiqo ah heerkul ah 4 °C. Dusha sare waxaa falanqeeyay HPLC-MS/MS.
Qaybaha PCR ee EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) iyo EcK2 (556 bp) ayaa laga soo saaray cDNA laga soo diyaariyey kaneecada madaxa la'aanta ah ee isku dhafan. Qaybta PCR ee xakamaynta eGFP (495 bp) waxaa laga soo xigtay pCR2.1-eGFP ee hore loo sharraxay; Tilmaamaha PCR waxaa lagu taxay Shaxda Xogta La Dheereeyay 2. Qaybaha PCR waxaa la geliyay inta u dhaxaysa kor u qaadayaasha T7 ee rogan ee ku yaal plasmid-ka pL4440. Dhismayaasha Plasmid waxaa laga soo helay NEB 5-α oo awood u leh E. coli (New England Biolabs) waxaana lagu xaqiijiyay taxanaha DNA ka hor inta aan la isticmaalin (fiiri Xogta Dheeraadka ah 1 si aad u hesho taxanaha gelinta). Astaamaha la jaanqaadaya kor u qaadayaasha T7 (Jadwalka Xogta La Dheereeyay 2) ayaa loo isticmaalay in lagu xoojiyo gelinta laga soo qaaday plasmid-ka ku salaysan pL4440. Cabbirka badeecada PCR waxaa xaqiijiyay agarose gel electrophoresis.dsRNA waxaa laga soo guuriyay qaababka PCR iyadoo la adeegsanayo Qalabka Qoraalka Megascript T7 (Thermo Fisher) waxaana la nadiifiyay iyadoo la raacayo tilmaamaha soo saaraha iyadoo wax laga beddelayo hore loo sharraxay.
Duritaanka dsRNA, 1,380 ng oo dsRNA ah (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) ayaa lagu duray isku-darka 10 ng nl-1 ee laabta ragga ama dumarka qaangaarka ah (Nanoject III, Drummond) 1 maalmood gudahood ka dib isku-darka. Heerarka hoos u dhaca hidda-wadaha waxaa lagu go'aamiyay ugu yaraan saddex nuqul oo bayooloji ah iyadoo la adeegsanayo soo saarista RNA, sameynta cDNA, iyo RT-qPCR. Duritaanka ecdysone, dumarka bikrada ah ee 4-maalmood jira ama 6-maalmood jira ee dhiigga quudiya waxaa lagu duray 0.13, 0.21, ama 0.63 µg oo ah 20E ama 3D20E (Nanoject III, Drummond) oo leh isku-darka 1.3, 2.1, siday u kala horreeyaan, iyadoo ku xiran naqshadda tijaabada ama 6.3 ng nl-1. Ku dur 100 nl oo ah 10% (vol/vol) ethanol biyo; 100 nl oo ah 3D20E22P oo ku jira 10% ethanol (oo u dhiganta 75% tirada laga helay labo MAGs). Kaneecada waxaa si aan kala sooc lahayn loogu qoondeeyay kooxda duritaanka.
Baaritaannada dhalmada, dheddigga 3-maalmood jira waxaa lagu quudin jiray dhiig bini'aadam. Ka saar kaneecada qayb ahaan la quudiyay ama aan la quudin. Iyada oo ku xidhan daawaynta, dheddigga waxaa la gelin jiray koob dhalmo oo kala duwan afar habeen ugu yaraan 48 saacadood ka dib cuntada dhiigga. Ukunta waxaa lagu tiriyay qalab isteeroscope ah (Stemi 508, Zeiss); dheddigga la isku daray, ukumaha u soo baxa dirxiga waxaa loo arkay inay bacrin yihiin.
Tijaabooyinka lammaanaynta, dheddigga waxaa loo oggolaaday ugu yaraan 2 maalmood iyadoo ku xiran daaweynta si ay u yeeshaan iska caabinta lammaanaynta, ragga da'da isku midka ah ee duurjoogta ahna waxaa markii dambe lagu soo daray qafis isku mid ah. Laba habeen ka dib, vesicles-ka dheddigga ee la bacrimiyey ayaa la kala qaaday oo DNA-da genomic-ga waxaa lagu sii daayay baraf-dhalaal iyo sonication oo ku jira kayd ay ku jiraan 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, iyo 25 mM NaCl (pH 8.2). Muunado waxaa lagu kululeeyay Proteinase K (0.86 µg µl-1) muddo 15 daqiiqo ah heerkul ah 55 °C, ka dibna 10 daqiiqo heerkul ah 95 °C. Diyaarinta DNA-da genomic-ga ee cayriin ayaa la qasi jiray 10-laab waxaana la mariyay ogaanshaha qPCR ee taxanaha koromosoomka Y; astaamaha waxaa lagu taxay Jadwalka Xogta ee La Fidiyay 2. Maqnaanshaha taxanaha koromosoomka Y waxay muujinaysaa inaysan jirin lammaanayn.
Tijaabooyinka dib-u-guurka, dheddigga la isku qasbay ayaa laga baaray jiritaanka xirmooyinka isku-guurka si loo xaqiijiyo xaaladda isku-guurka waxaana loo oggolaaday 2 maalmood inay yeeshaan iska-caabin ku aaddan isku-guurka marka aysan jirin ragga, sida hore loogu sharraxay 36. Ragga sita shahwada isku-guurka ee DsRed ayaa markaa lagu soo bandhigay qafisyada dheddigga. Laba habeen ka dib, xididdada bacrimiinta ayaa laga soo saaray dheddigga, DNA-da hidde-sidahana waa la diyaariyey sida kor lagu sharaxay waxaana la siiyay ogaanshaha qPCR ee transgene-ka DsRed; astaamaha waxaa lagu taxay Jadwalka Xogta ee La Fidiyay 2. Maqnaanshaha transgene-ka DsRed waxay muujisay in aan dib-u-guurku dhicin.
3D20E waxaa loo sameeyay sidii hore loogu sharraxay 37. Si kooban, 10 mg oo 20E ah (Sigma-Aldrich) ayaa lagu milmay 10 ml oo biyo ah, waxaana ku xigay 30 mg oo ah madowga platinum (qaab budo ah, Sigma-Aldrich). Durdur jilicsan oo O2 ah ayaa si joogto ah loogu shubay isku darka falcelinta, kaas oo lagu walaaqay heerkulka qolka. 6 saacadood ka dib, 30 mL oo methanol ah ayaa lagu daray si loo joojiyo falcelinta. Isku darka waxaa lagu centrifugeeeyay si looga saaro walxaha kiciyaha. Dusha sare waxaa lagu uumi bixiyay si uu u qalalo vacuo heerkulka qolka. Badeecada falcelinta qalalan waxaa lagu milmay 10% ethanol iyo methanol si loogu duro falanqaynta HPLC-MS/MS. Heerka beddelka (laga bilaabo 20E ilaa 3D20E) wuxuu ahaa qiyaastii 97% (Jaantuska 4b), iyo MS spectrum ee 3D20E ee la sameeyay ayaa la mid ahaa kuwa laga helay dumarka la isku daray (Jaantuska 4c).
Halyeeygu wuxuu ka kooban yahay faahfaahin gaar ah oo ku saabsan tijaabooyinka tirakoobka ee la sameeyay. GraphPad (nooca 9.0) waxaa loo isticmaalay in lagu sameeyo imtixaanka saxda ah ee Fisher, imtixaanka Mantel-Cox, iyo imtixaanka t-test ee Ardayga. Imtixaanada Cochran-Mantel-Haenszel waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo qoraal R gaar ah (oo laga heli karo https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Qaybinta xogta waxaa lagu tijaabiyay caadi ahaan iyadoo la isticmaalayo tijaabada Shapiro-Wilk oo leh heer muhiim ah oo ah 0.05. Markii xogtu ku guuldareysatay tijaabada caadiga ah, tijaabada Mann-Whitney ayaa la sameeyay. Xogta badbaadada waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo tijaabada Mantel-Cox. Xirmada DESeq2 (nooca 1.28.1) waxaa loo isticmaalay in lagu sameeyo falanqaynta muujinta kala duwan ee heerka hidde-sidaha RNA-seq. Barka toosan ee garaafka wuxuu matalaa dhexdhexaadka. Qiimaha muhiimka ah ee P = 0.05 ayaa loo isticmaalay heerka dhammaan imtixaanada.
Wixii macluumaad dheeraad ah oo ku saabsan naqshadeynta daraasadda, fiiri qoraalka Warbixinta Cilmi-baarista Dabeecadda ee ku xiran maqaalkan.
Xogta MS proteomic waxaa lagu shubay ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) iyada oo loo marayo Kaydka PRIDE Partner (https://www.ebi.ac.uk/pride/) iyada oo la adeegsanayo aqoonsiga xogta PXD032157.
Xogta RNA-seq waxaa lagu kaydiyaa Maktabadda Dhammaystiran ee Muujinta Gene (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) iyadoo la raacayo diiwaanka taxanaha ah ee GSE198665.
Xog ururin dheeraad ah oo la sameeyay iyo/ama la falanqeeyay inta lagu jiro daraasadda hadda socota waxaa laga heli karaa qorayaasha u dhigma marka la codsado macquul. Maqaalkani wuxuu bixinayaa xogta isha.
De Loof, A. Ecdysteroids: Steroids galmo cayayaan ah oo la dayacay? Lab: Sanduuqa Madow. Sayniska Cayayaanka.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hydroxyecdysone iyo horumarinta ugxan-sidaha ee Anopheles stephens. J. Fiisiyoolajiyadda Cayayaanka.28, 97–109 (1982).