Dheef-shiid kiimikaadka difaaca jirka waa astaamo muhiim ah oo ka mid ah deegaanka burooyinka (TME), laakiin marka laga reebo dhowr, aqoonsigooda ayaa weli aan la aqoon. Halkan, waxaan ku falanqeynay burooyinka iyo unugyada T ee ka soo baxa burooyinka iyo ascites-ka bukaanada qaba kansarka heerka sare ee serous carcinoma (HGSC) si aan u muujino metabolome-ka qaybahan kala duwan ee TME. Ascites iyo unugyada burooyinka waxay leeyihiin kala duwanaansho metabolite oo ballaaran. Marka la barbardhigo ascites, unugyada T ee burooyinka soo galaya waxaa si weyn loogu hodan yahay 1-methylnicotinamide (MNA). Inkasta oo heerka MNA ee unugyada T uu sareeyo, muujinta nicotinamide N-methyltransferase (enzyme ka qaybqaata wareejinta kooxaha methyl ee S-adenosylmethionine una gudubta nicotinamide) waxay ku kooban tahay fibroblasts iyo unugyada burooyinka. Si firfircoon, MNA waxay ku dhiirigelisaa unugyada T inay soo saaraan cytokine-ka burooyinka ee necrosis factor alpha. Sidaa darteed, MNA-da laga soo qaatay TME waxay gacan ka geysataa nidaaminta difaaca jirka ee unugyada T waxayna u taagan tahay bartilmaameed difaac oo suurtagal ah oo loogu talagalay daaweynta kansarka aadanaha.
Dheef-shiid kiimikaadka laga helo burooyinka ayaa saameyn weyn ku yeelan kara difaaca jirka ee ka hortagga burooyinka, waxaana jira caddaymo badan oo muujinaya inay sidoo kale u adeegi karaan sidii xoog muhiim ah oo horseeda horumarka cudurka (1). Marka laga soo tago saameynta Warburg, shaqada dhowaan la qabtay waxay bilaabatay inay sifeyso xaaladda dheef-shiid kiimikaadka ee unugyada burooyinka iyo xiriirka ay la leedahay xaaladda difaaca jirka ee deegaanka burooyinka (TME). Daraasado ku saabsan moodooyinka jiirka iyo unugyada T-ga aadanaha ayaa muujiyay in dheef-shiid kiimikaadka glutamine (2), dheef-shiid kiimikaadka oksaydhka (3) iyo dheef-shiid kiimikaadka gulukooska (4) ay si madax-bannaan ugu dhaqmi karaan kooxo kala duwan oo unugyada difaaca jirka ah. Dhowr dheef-shiid kiimikaad oo ku jira waddooyinkan ayaa xannibaya shaqada ka hortagga burooyinka ee unugyada T. Waxaa la xaqiijiyay in xannibaadda coenzyme tetrahydrobiopterin (BH4) ay dhaawici karto faafitaanka unugyada T, kororka BH4 ee jirkana wuxuu kor u qaadi karaa jawaabta difaaca jirka ee ka hortagga burooyinka oo ay dhexdhexaadinayaan CD4 iyo CD8. Intaa waxaa dheer, saameynta difaaca jirka ee kynurenine waxaa lagu badbaadin karaa maamulka BH4 (5). Marka la eego glioblastoma-ka mutant-ka ah ee isocitrate dehydrogenase (IDH), soo saarista enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) waxay joojisaa dhaqdhaqaaqa unugyada T, faafitaanka iyo dhaqdhaqaaqa cytolysis (6). Dhawaan, waxaa la muujiyay in methylglyoxal, oo ah wax soo saar ka soo baxa glycolysis, ay soo saaraan unugyada xakamaynta ee asal ahaan ka soo jeeda myeloid, wareejinta unugyada T ee methylglyoxal-na waxay joojin kartaa shaqada unugyada T ee saamaynta leh. Daaweynta, dhexdhexaadinta methylglyoxal waxay ka gudbi kartaa dhaqdhaqaaqa unugyada xakamaynta ee ka soo jeeda myeloid (MDSC) waxayna si wada jir ah u xoojin kartaa daaweynta xannibaadda koontaroolka ee moodooyinka jiirka (7). Daraasadahani waxay si wadajir ah u xoojinayaan doorka muhiimka ah ee metabolites-ka ka soo jeeda TME ee nidaaminta shaqada iyo dhaqdhaqaaqa unugyada T.
Cilladda unugyada T ayaa si weyn looga soo sheegay kansarka ugxan-sidaha (8). Tani waxay qayb ahaan sabab u tahay astaamaha dheef-shiid kiimikaadka ee ku jira hypoxia iyo xididdada burooyinka aan caadiga ahayn (9), taasoo keenta in gulukooska iyo tryptophan loo beddelo wax soo saar sida lactic acid iyo kynurenine. Lactate-ka xad-dhaafka ah ee ka baxsan unugyada ayaa yareeya soo saarista interferon-γ (IFN-γ) wuxuuna kiciyaa kala duwanaanshaha kooxaha myelosuppressive (10, 11). Isticmaalka tryptophan si toos ah ayuu u joojiyaa faafitaanka unugyada T wuxuuna joojiyaa calaamadaynta soo-dhoweeyaha unugyada T (12-14). Iyadoo ay jiraan indha-indheyntan, shaqo badan oo ku xeeran dheef-shiid kiimikaadka difaaca jirka ayaa lagu sameeyay dhaqanka unugyada T ee in vitro iyadoo la adeegsanayo warbaahinta la hagaajiyay, ama lagu xaddiday moodooyinka jiirka ee isku midka ah ee vivo, midkoodna si buuxda uma muujinayo kala duwanaanshaha kansarka aadanaha iyo deegaanka macro iyo micro ee jirka.
Astaanta caadiga ah ee kansarka ugxan-sidaha waa faafitaanka xuubka hoose iyo muuqaalka ascites. Isu-ururinta dareeraha unugyada ee ascites-ka waxay la xiriirtaa cudur horumarsan iyo saadaalin liidata (15). Sida laga soo xigtay warbixinnada, qaybtan gaarka ah waa hypoxic, waxay leedahay heerar sare oo ah factor koritaanka endothelial-ka xididdada dhiigga (VEGF) iyo indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO), waxaana dhex gala unugyada nidaamiya T iyo unugyada ka hortagga myeloid (15-18). Deegaanka dheef-shiid kiimikaadka ee ascites-ka ayaa laga yaabaa inuu ka duwanaado kan burooyinka laftooda, sidaa darteed dib-u-barnaamijka unugyada T ee booska xuubka hoose ma cadda. Intaa waxaa dheer, kala duwanaanshaha muhiimka ah iyo kala duwanaanshaha u dhexeeya ascites iyo metabolites-ka ku jira deegaanka burooyinka ayaa laga yaabaa inay carqaladeeyaan gelitaanka unugyada difaaca jirka iyo shaqadooda burooyinka, waxaana loo baahan yahay cilmi-baaris dheeraad ah.
Si loo xalliyo dhibaatooyinkan, waxaan naqshadeynay habka kala soocidda unugyada xasaasiga ah iyo chromatography dareeraha ah ee tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) si loo barto noocyada kala duwan ee unugyada (oo ay ku jiraan unugyada CD4 + iyo CD8 + T) iyo sidoo kale gudaha iyo inta u dhaxaysa burooyinka. Dheelitirka metabolites-ku wuxuu ku fidaa unugyada ku jira isla ascites iyo deegaanka burooyinka ee bukaanka. Waxaan u isticmaalnaa habkan iyadoo lala kaashanayo cytometry socodka cabbirka sare iyo isku xigxiga RNA-ka hal-unug (scRNA-seq) si loo bixiyo sawir aad loo xalliyay oo ku saabsan xaaladda dheef-shiid kiimikaadka ee dadkan muhiimka ah. Habkani wuxuu muujiyay koror weyn oo ku yimid heerka 1-methylnicotinamide (MNA) ee unugyada burooyinka T, tijaabooyinka in vitro-na waxay muujiyeen in saameynta immunomodulatory ee MNA ee shaqada unugyada T aan hore loo aqoon. Guud ahaan, habkani wuxuu muujinayaa isdhexgalka dheef-shiid kiimikaadka ee u dhexeeya burooyinka iyo unugyada difaaca jirka, wuxuuna bixiyaa aragtiyo gaar ah oo ku saabsan metabolityada nidaaminta difaaca jirka, kuwaas oo laga yaabo inay faa'iido u leeyihiin daaweynta difaaca jirka ee kansarka ugxan-sidaha ee ku salaysan unugyada T fursadaha daaweynta.
Waxaan isticmaalnay cytometry socodka cabbirka sare si aan isku mar u cabbirno qaadashada gulukooska [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) waa calaamado caadi ah oo dhinac ah oo kala sooca unugyada difaaca jirka iyo tirada unugyada burooyinka (Jadwalka S2 iyo Jaantuska S1A). Falanqayntani waxay muujisay in marka la barbardhigo unugyada T, ascites iyo unugyada burooyinka ay leeyihiin heerar sare oo qaadashada gulukooska ah, laakiin ay leeyihiin farqi yar oo ku yimaada dhaqdhaqaaqa mitochondrial. Celceliska qaadashada gulukooska ee unugyada burooyinka [CD45-EpCAM (EpCAM)+] waa saddex ilaa afar jeer ka badan unugyada T, celceliska qaadashada gulukooska ee unugyada CD4 + T waa 1.2 jeer ka badan unugyada CD8 + T, taasoo muujinaysa in lymphocytes-ka burooyinka ee soo gala (TIL) ay leeyihiin shuruudo dheef-shiid kiimikaad oo kala duwan xitaa isla TME (Jaantuska 1A). Taas bedelkeeda, dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee unugyada burooyinka wuxuu la mid yahay kan unugyada CD4 + T, dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee labada nooc ee unugyadana wuxuu ka sarreeyaa kan unugyada CD8 + T (Jaantuska 1B). Guud ahaan, natiijooyinkani waxay muujinayaan heerka dheef-shiid kiimikaadka. Dhaqdhaqaaqa dheef-shiid kiimikaadka ee unugyada burooyinka ayaa ka sarreeya kan unugyada CD4 + T, dhaqdhaqaaqa dheef-shiid kiimikaadka ee unugyada CD4 + T wuxuu ka sarreeyaa kan unugyada CD8 + T. Iyadoo ay jiraan saameyntan noocyada unugyada, ma jiraan wax farqi ah oo joogto ah oo ku saabsan xaaladda dheef-shiid kiimikaadka ee unugyada CD4 + iyo CD8 + T ama saamigooda qaraabada ah ee ascites marka la barbar dhigo burooyinka (Jaantuska 1C). Taas bedelkeeda, qaybta unugyada CD45-ka, saamiga unugyada EpCAM+ ee burooyinka ayaa kordhay marka la barbar dhigo ascites (Jaantuska 1D). Waxaan sidoo kale aragnay farqi dheef-shiid kiimikaad oo cad oo u dhexeeya qaybaha unugyada EpCAM+ iyo EpCAM-. Unugyada EpCAM+ (buro) waxay leeyihiin qaadashada gulukooska oo ka sarreeya iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial marka loo eego unugyada EpCAM-, kaas oo aad uga sarreeya dhaqdhaqaaqa dheef-shiid kiimikaadka ee fibroblasts ee unugyada burooyinka ee TME (Jaantuska 1, E iyo F).
(A iyo B) Xoogga iftiinka dhexdhexaadka ah (MFI) ee qaadashada gulukooska (2-NBDG) (A) iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee unugyada CD4 + T (MitoTracker casaan madow) (B) Garaafyada matalaya (bidix) iyo xogta shaxda (Midig), unugyada CD8 + T iyo unugyada EpCAM + CD45-buro ee ka imanaya ascites iyo burooyinka. (C) Saamiga unugyada CD4 + iyo CD8 + (unugyada CD3 + T) ee ascites iyo burooyinka. (D) Saamiga unugyada EpCAM + burooyinka ee ascites iyo burooyinka (CD45−). (E iyo F) EpCAM + CD45-bumor iyo EpCAM-CD45-matrix qaadashada gulukooska (2-NBDG) (E) iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial (MitoTracker casaan madow) (F) garaafyada matalaya (bidix) iyo xogta shaxda (Midig) Ascites iyo unugyada burooyinka. (G) Garaafyada matalaya ee muujinta CD25, CD137 iyo PD1 iyadoo loo marayo cytometry socodka. (H iyo I) Muujinta CD25, CD137 iyo PD1 ee unugyada CD4 + T (H) iyo unugyada CD8 + T (I). (J iyo K) Noocyada xusuusta dhexe (Tcm), saamaynta (Teff) iyo xusuusta saamaynta (Tem) oo ku salaysan muujinta CCR7 iyo CD45RO. Sawirro matalaya (bidix) iyo xogta shaxda (midig) ee unugyada CD4 + T (J) iyo unugyada CD8 + T (K) ee ascites iyo burooyinka. Qiimaha P waxaa go'aamiya tijaabada t-ga ee lammaaneeyay (*P<0.05, **P<0.01 iyo ***P<0.001). Khadku wuxuu matalaa bukaanada isku midka ah (n = 6). FMO, fluorescence laga jaray hal; MFI, xoojinta fluorescence dhexdhexaad ah.
Falanqayn dheeraad ah ayaa shaaca ka qaaday kala duwanaansho kale oo muhiim ah oo u dhexeeya xaaladda fenotypic-ga unugyada T ee aadka loo xalliyay. Xusuusta firfircoon (Jaantuska 1, G ilaa I) iyo xusuusta falgalka (Jaantuska 1, J iyo K) ee burooyinka ayaa aad uga badan ascites (saamiga unugyada CD3 + T). Sidoo kale, falanqaynta fenotyga iyadoo la adeegsanayo muujinta calaamadaha firfircoonida (CD25 iyo CD137) iyo calaamadaha dhimista [borotiinka dhimashada unugyada ee la barnaamijiyay 1 (PD1)] waxay muujisay in inkastoo astaamaha dheef-shiid kiimikaadka ee dadkani ay kala duwan yihiin (Jaantuska S1, B ilaa E), Laakiin ma jirin farqi weyn oo dheef-shiid kiimikaad oo si joogto ah loogu arkay qaybaha hoose ee aan caadiga ahayn, kuwa wax saameynaya ama xusuusta (Jaantuska S1, F ilaa I). ​​Natiijooyinkan waxaa lagu xaqiijiyay iyadoo la adeegsanayo hababka barashada mashiinka si toos ah loogu qoondeeyo noocyada unugyada (21), taas oo sii muujisay joogitaanka tiro badan oo unugyada dhuuxa lafta (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) ee ascites-ka bukaanka (Jaantuska S2A). Dhammaan noocyada unugyada la aqoonsaday, dadkan unugyada myeloid-ka ah waxay muujiyeen qaadashada gulukooska ugu sarreysa iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial (Jaantuska S2, B ilaa G). Natiijooyinkani waxay muujinayaan kala duwanaanshaha dheef-shiid kiimikaadka ee xooggan ee u dhexeeya noocyada unugyada badan ee laga helo ascites iyo burooyinka bukaanada HGSC.
Caqabadda ugu weyn ee lagu fahmo astaamaha dheef-shiid kiimikaadka ee TIL waa baahida loo qabo in la kala saaro muunadaha unugyada T ee daahirnimo ku filan, tayo iyo tiro ku filan burooyinka. Daraasado dhowaan la sameeyay ayaa muujiyay in kala soocidda iyo hababka kobcinta kuusha ee ku salaysan cytometry socodka ay horseedi karto isbeddello ku yimaada astaamaha dheef-shiid kiimikaadka unugyada (22-24). Si looga gudbo dhibaatadan, waxaan hagaajinay habka kobcinta kuusha si aan uga go'doominno oo aan uga go'doominno TIL kansarka ugxan-sidaha aadanaha ee qalliinka laga saaray ka hor falanqaynta LC-MS/MS (fiiri Qalabka iyo Hababka; Jaantuska 2A). Si loo qiimeeyo saameynta guud ee hab-maamuuskani ku leeyahay isbeddellada dheef-shiid kiimikaadka, waxaan isbarbar dhignay astaamaha dheef-shiid kiimikaadka ee unugyada T ee ay dhaqaajiyeen deeq-bixiyeyaasha caafimaadka qaba ka dib tallaabada kala-soocidda kuusha ee kor ku xusan iyo unugyada aan la kala saarin kuusha laakiin ku sii jiray barafka. Falanqayntan xakamaynta tayada ayaa lagu ogaaday in ay jirto isku xirnaan sare oo u dhaxaysa labadan xaaladood (r = 0.77), iyo ku celcelinta farsamada ee kooxda 86 metabolites waxay leedahay ku celcelin sare (Jaantuska 2B). Sidaa darteed, hababkani waxay samayn karaan falanqayn sax ah oo ku saabsan metabolite-ka unugyada ee lagu kobcinayo nooca unugyada, sidaas darteedna waxay bixiyaan madalkii ugu horreeyay ee xallinta sare leh ee lagu aqoonsanayo metabolite-yada gaarka ah ee HGSC, taasoo awood u siinaysa dadka inay si qoto dheer u fahmaan gaar ahaanshaha unugyada barnaamijka dheef-shiid kiimikaadka galmada.
(A) Jaantuska jaantuska ee kobcinta kuul birlabeedka. Kahor falanqaynta LC-MS/MS, unugyadu waxay mari doonaan saddex wareeg oo isku xigta oo kobcinta kuul birlabeed ah ama waxay ku sii jiri doonaan baraf. (B) Saamaynta nooca kobcinta kuul badan oo metabolites ah. Celceliska saddex cabbir nooc kasta oo kobcinta ± SE ah. Khadka cawlan wuxuu matalaa xiriir 1:1 ah. Isku xidhka fasalka dhexdiisa (ICC) ee cabbiraadaha soo noqnoqda ee lagu muujiyay calaamadda dhidibka. NAD, nicotinamide adenine dinucleotide. (C) Jaantuska jaantuska ee socodka shaqada ee falanqaynta dheef-shiid kiimikaadka bukaanka. Ascites ama burooyinka waxaa laga soo ururiyaa bukaanada waxaana la kaydiyaa cryopreserved. Qayb yar oo ka mid ah muunad kasta waxaa lagu falanqeeyay cytometry socodka, halka muunadaha soo harayna lagu sameeyay saddex wareeg oo kobcinta unugyada CD4+, CD8+ iyo CD45-. Qaybaha unugyadan waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la adeegsanayo LC-MS/MS. (D) Khariidadda kulaylka ee tirada metabolite ee la cayimay. Dendrogram-ku wuxuu matalaa isku-darka Ward ee masaafada Euclidean ee u dhaxaysa muunadaha. (E) Falanqaynta qaybaha ugu muhiimsan (PCA) ee khariidadda metabolite-ka muunadda, oo muujinaysa saddex nuqul oo muunad kasta ah, muunado laga soo qaaday isla bukaan ayaa lagu xirayaa xariiq. (F) PCA-ga astaanta metabolite-ka ee muunadda lagu xidhay bukaanka (tusaale ahaan, iyadoo la isticmaalayo dib-u-dhac qayb ahaan ah); nooca muunadda waxaa xaddidaya qolofka qaloocan. PC1, qaybta ugu weyn 1; PC2, qaybta ugu weyn 2.
Marka xigta, waxaan adeegsannay habkan kobcinta si aan u falanqeyno 99 metabolites oo ku jira jajabyada unugyada CD4 +, CD8 + iyo CD45 ee unugyada ascites-ka aasaasiga ah iyo burooyinka lix bukaan oo HGSC ah (Jaantuska 2C, Jaantuska S3A iyo Shaxda S3 iyo S4). Dadka danaynaya waxay u dhigmaan 2% ilaa 70% muunadda weyn ee asalka ah ee unugyada nool, saamiga unugyaduna aad ayuu ugu kala duwan yahay bukaanada. Ka dib markii la kala saaro ul, qaybta hodanka ah ee xiisaha (CD4+, CD8+ ama CD45-) waxay ka dhigan tahay in ka badan 85% dhammaan unugyada nool ee muunadda ku jira celcelis ahaan. Habkan kobcinta wuxuu noo ogolaanayaa inaan falanqeyno tirada unugyada laga bilaabo dheef-shiid kiimikaadka unugyada kansarka aadanaha, taas oo aan macquul ahayn in laga sameeyo muunado waaweyn. Annagoo adeegsanayna hab-maamuuskaan, waxaan go'aansannay in l-kynurenine iyo adenosine, labadan metabolites ee difaaca jirka ee si fiican loo yaqaan ay ku badan yihiin unugyada burooyinka T ama unugyada burooyinka (Jaantuska S3, B iyo C). Sidaa darteed, natiijooyinkani waxay muujinayaan daacadnimada iyo awoodda kala-soocidda unugyadayada iyo tignoolajiyada spectrometry-ga si loo helo metabolites muhiim u ah bayoolojiga unugyada bukaanka.
Falanqaynteennu waxay sidoo kale muujisay kala soocid xooggan oo dheef-shiid kiimikaad ah oo noocyada unugyada ah gudaha iyo inta u dhaxaysa bukaanada (Jaantuska 2D iyo Sawirka S4A). Gaar ahaan, marka la barbardhigo bukaanada kale, bukaanka 70 waxay muujiyeen astaamo dheef-shiid kiimikaad oo kala duwan (Jaantuska 2E iyo Sawirka S4B), taasoo muujinaysa in ay jiri karto kala duwanaansho dheef-shiid kiimikaad oo weyn oo u dhexeeya bukaanada. Waxaa xusid mudan in marka la barbardhigo bukaanada kale (1.2 ilaa 2 litir; Shaxda S1), wadarta guud ee ascites-ka laga soo ururiyey bukaanka 70 (80 ml) ay ka yarayd. Xakamaynta kala duwanaanshaha bukaanada dhexdooda inta lagu jiro falanqaynta qaybaha ugu muhiimsan (tusaale ahaan, iyadoo la adeegsanayo falanqaynta qayb ka mid ah ee dib-u-dhaca) waxay muujinaysaa isbeddello joogto ah oo u dhexeeya noocyada unugyada, noocyada unugyada iyo/ama deegaanka yar-yarna si cad ayaa loo ururiyaa iyadoo loo eegayo astaamaha dheef-shiid kiimikaadka (Jaantuska 2F). Falanqaynta metabolite-yada keligood ah waxay xoogga saartay saamayntan waxayna muujisay kala duwanaansho muhiim ah oo u dhexeeya noocyada unugyada iyo deegaanka yar-yar. Waxaa xusid mudan in farqiga ugu daran ee la arkay uu yahay MNA, kaas oo inta badan lagu kobciyo unugyada CD45- iyo unugyada CD4+ iyo CD8+ ee ku dhex milma burooyinka (Jaantuska 3A). Unugyada CD4 +, saameyntani waa mid aad u muuqata, MNA-da ku jirta unugyada CD8 + sidoo kale waxay u muuqataa inay si xooggan u saamaysay deegaanka. Si kastaba ha ahaatee, tani muhiim ma aha, sababtoo ah saddex ka mid ah lixda bukaan oo keliya ayaa lagu qiimayn karaa dhibcaha burooyinka CD8+. Marka laga soo tago MNA, noocyada kala duwan ee unugyada ku jira ascites iyo burooyinka, metabolites-ka kale ee si liidata loogu garto TIL sidoo kale waa kuwo hodan ah (Jaantusyada S3 iyo S4). Sidaa darteed, xogtani waxay muujinaysaa koox rajo leh oo metabolites-ka difaaca jirka ah si loo sameeyo cilmi-baaris dheeraad ah.
(A) Waxyaabaha caadiga ah ee MNA ee ku jira unugyada CD4+, CD8+ iyo CD45- ee ka yimaada ascites iyo burooyinka. Shaxda sanduuqa waxay muujinaysaa dhexdhexaadka (khadka), kala duwanaanshaha isku-dhafka ah (jiidashada qaab-dhismeedka) iyo kala duwanaanshaha xogta, ilaa 1.5 jeer kala duwanaanshaha isku-dhafka ah (fiiqa qaab-dhismeedka). Sida lagu sharaxay Qalabka Bukaanka iyo Hababka, isticmaal qiimaha lima ee bukaanka si aad u go'aamiso qiimaha P (*P<0.05 iyo **P<0.01). (B) Jaantuska jaantuska ee dheef-shiid kiimikaadka MNA (60). Dheef-shiid kiimikaadka: S-adenosyl-1-methionine; SAH, S-adenosine-1-homocysteine; NA, nicotinamide; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide; 4-PY, 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Ensaymyada (cagaar): NNMT, nicotinamide N-methyltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldehyde oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, purine nucleoside phosphorylase. (C) t-SNE ee scRNA-seq ee ascites (cawlan) iyo buro (casaan; n = 3 bukaan). (D) Muujinta NNMT ee dadka unugyada kala duwan ee lagu aqoonsaday iyadoo la adeegsanayo scRNA-seq. (E) Muujinta NNMT iyo AOX1 ee SK-OV-3, kelyaha embriyaha aadanaha (HEK) 293T, unugyada T iyo unugyada T ee MNA lagu daweeyay. Muujinta laalaaban waxaa lagu muujiyay marka loo eego SK-OV-3. Qaabka muujinta ee SEM ayaa la muujiyay (n = 6 deeq-bixiyeyaal caafimaad qaba). Qiimaha Ct ee ka weyn 35 waxaa loo arkaa mid aan la ogaan karin (UD). (F) Muujinta SLC22A1 iyo SLC22A2 ee unugyada SK-OV-3, HEK293T, unugyada T iyo unugyada T ee lagu daweeyay 8mM MNA. Muujinta laalaaban waxaa lagu muujiyay marka loo eego SK-OV-3. Qaabka muujinta ee SEM ayaa la muujiyay (n = 6 deeq-bixiyeyaal caafimaad qaba). Qiimaha Ct ee ka weyn 35 waxaa loo arkaa mid aan la ogaan karin (UD). (G) Waxyaabaha ku jira unugyada MNA ee unugyada deeq-bixiyeyaasha caafimaadka qaba ee firfircoon ka dib 72 saacadood oo lagu beeray MNA. Qaabka muujinta ee SEM ayaa la muujiyay (n = 4 deeq-bixiyeyaal caafimaad qaba).
MNA waxaa lagu soo saaraa iyadoo kooxda methyl-ka laga wareejiyo S-adenosyl-1-methionine (SAM) una wareejiyo nicotinamide (NA) iyadoo la adeegsanayo nicotinamide N-methyltransferase (NNMT; Jaantuska 3B). NNMT waxaa si xad dhaaf ah loogu muujiyaa noocyo kala duwan oo kansarro ah oo aadanaha ah waxaana lala xiriiriyaa faafitaanka, duullaanka iyo metastasis (25-27). Si aan si fiican u fahanno isha MNA ee unugyada T ee TME, waxaan isticmaalnay scRNA-seq si aan u sifeyno muujinta NNMT ee noocyada unugyada ee ascites iyo burooyinka saddex bukaan oo HGSC ah (Jadwalka S5). Falanqaynta qiyaastii 6,500 oo unug ayaa muujisay in ascites iyo deegaannada burooyinka, muujinta NNMT ay ku kooban tahay dadka la filayo ee fibroblast iyo unugyada burooyinka (Jaantuska 3, C iyo D). Waxaa xusid mudan in aysan jirin muujinta NNMT ee muuqata ee dad kasta oo muujiya PTPRC (CD45 +) (Jaantuska 3D iyo Jaantuska S5A), taas oo tilmaamaysa in MNA laga helay spectrum-ka metabolite-ka lagu soo daray unugyada T. Muujinta aldehyde oxidase 1 (AOX1) waxay MNA u beddeshaa 1-methyl-2-pyridone-5-carboxamide (2-PYR) ama 1-methyl-4-pyridone-5-carboxamide (4-PYR); Jaantuska 3B) sidoo kale wuxuu ku kooban yahay tirada fibroblasts-ka muujinaya COL1A1 (Jaantuska S5A), kuwaas oo si wada jir ah u tilmaamaya in unugyada T aysan lahayn awoodda dheef-shiid kiimikaadka MNA ee caadiga ah. Qaabka muujinta hiddo-wadahaan la xiriira MNA waxaa lagu xaqiijiyay iyadoo la adeegsanayo xog unug oo madax-bannaan oo labaad oo laga soo qaatay ascites-ka bukaanada HGSC (Jaantuska S5B; n = 6) (16). Intaa waxaa dheer, falanqaynta falgalka silsiladda polymerase ee tirada (qPCR) ee unugyada T ee deeq-bixiyeyaasha caafimaadka qaba ee lagu daaweeyay MNA waxay muujisay in marka la barbar dhigo unugyada burooyinka ugxan-sidaha ee xakamaynta SK-OV-3, NNMT ama AOX1 aan ku dhowaad la muujin (Jaantuska 3E). Natiijooyinkan lama filaanka ah waxay muujinayaan in MNA laga yaabo in laga soo saaro fibroblasts ama burooyinka unugyada T ee ku xiga TME.
In kasta oo musharixiintu ay ku jiraan qoyska gaadiidleyda cation-ka dabiiciga ah 1 ilaa 3 (OCT1, OCT2 iyo OCT3) oo ay codeeyeen qoyska side-ka milma 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 iyo SLC22A3), gaadiidleyda suurtagalka ah ee MNA weli lama qeexin (28). QPCR ee mRNA ee ka imanaya unugyada T-ga deeq-bixiyeyaasha caafimaadka qaba waxay muujiyeen heerar hoose oo muujin ah oo SLC22A1 ah laakiin aan la ogaan karin oo ah SLC22A2, taas oo xaqiijisay in hore loogu soo sheegay suugaanta (Jaantuska 3F) (29). Taas bedelkeeda, khadka unugyada burooyinka ugxan-sidaha ee SK-OV-3 wuxuu muujiyay heerar sare oo labada gaadiid-qaadayaal ah (Jaantuska 3F).
Si loo tijaabiyo suurtagalnimada in unugyada T ay awood u leeyihiin inay nuugaan MNA shisheeye, unugyada T ee deeq-bixiyeyaasha caafimaadka qaba ayaa la beeray 72 saacadood iyadoo ay joogaan fiirsashooyin kala duwan oo MNA ah. Maqnaanshaha MNA dibadda ah, unugyada MNA ee firfircoon lama ogaan karo (Jaantuska 3G). Si kastaba ha ahaatee, unugyada T ee firfircoon ee lagu daaweeyay MNA dibadda ah waxay muujiyeen koror ku xiran qiyaasta ku jirta maadada MNA ee unugyada, ilaa 6 mM MNA (Jaantuska 3G). Natiijadani waxay muujinaysaa in inkastoo heerka hoose ee muujinta qaadaha iyo la'aanta enzyme-ka ugu weyn ee mas'uulka ka ah dheef-shiid kiimikaadka MNA gudaha unugyada, TIL wali waxay qaadan kartaa MNA.
Kala duwanaanshaha metabolites-ka ee unugyada T ee bukaanada iyo tijaabooyinka nuugista MNA ee vitro waxay kordhinayaan suurtagalnimada in fibroblasts-ka la xiriira kansarka (CAF) ay soo saaraan MNA, unugyada burooyinkana waxay nidaamin karaan nooca iyo shaqada TIL. Si loo go'aamiyo saameynta MNA ee unugyada T, unugyada T ee deeq-bixiyeyaasha caafimaadka qaba ayaa lagu hawlgeliyay in vitro iyadoo ay joogaan ama maqan yihiin MNA, waxaana la qiimeeyay kororka iyo wax-soo-saarka cytokine-ka. Ka dib 7 maalmood oo lagu daray MNA qiyaasta ugu sarreysa, tirada labanlaabma ee dadweynaha ayaa si dhexdhexaad ah loo dhimay, halka firfircoonida la ilaaliyay dhammaan qiyaasaha (Jaantuska 4A). Intaa waxaa dheer, daaweynta MNA-da dibadda waxay keentay koror ku yimid saamiga unugyada CD4 + iyo CD8 + T ee muujinaya burooyinka necrosis factor-α (TNFα; Sawirka 4B). Taas bedelkeeda, wax-soo-saarka unugyada ee IFN-γ ayaa si weyn hoos ugu dhacay unugyada CD4 + T, laakiin ma jirin unugyada CD8 + T, mana jirin isbeddel muhiim ah oo ku yimid interleukin 2 (IL-2; Sawirka 4, C iyo D). Sidaa darteed, baaritaanka immunosorbent-ka ee ensaymka ku xiran (ELISA) ee ka-soo-baxa unugyada T ee lagu daweeyay MNA wuxuu muujiyay koror weyn oo ku yimid TNFα, hoos u dhac ku yimid IFN-γ, iyo isbeddel la'aan ku yimid IL-2 (Jaantuska 4, E ilaa G). . Hoos u dhaca IFN-γ wuxuu muujinayaa in MNA ay door ka ciyaari karto joojinta dhaqdhaqaaqa ka-hortagga burooyinka ee unugyada T. Si loo matalo saameynta MNA ee sunta unugyada T, unugyada chimeric antigen receptor T (FRα-CAR-T) ee bartilmaameedsanaya receptor folate α iyo CAR-T (GFP) oo ay nidaamiyaan borotiinka cagaaran ee fluorescent (GFP) -CAR-T) waxaa soo saara unugyada dhiigga ee deeq-bixiyeyaasha ee caafimaadka qaba (PBMC). Unugyada CAR-T waxaa la beeray 24 saacadood iyadoo ay joogaan MNA, ka dibna waxaa lala beeray unugyada burooyinka ugxan-sidaha ee SK-OV-3 ee aadanaha oo muujinaya receptor folate α saamiga saamaynta iyo bartilmaameedka ee 10:1. Daawaynta MNA waxay keentay hoos u dhac weyn oo ku yimid dhaqdhaqaaqa dilka ee unugyada FRα-CAR-T, kaas oo la mid ahaa unugyada FRα-CAR-T ee lagu daweeyay adenosine (Jaantuska 4H).
(A) Tirada guud ee unugyada nool iyo tirada dadka oo labanlaabma (PD) si toos ah uga timid dhaqanka maalinta 7aad. Garaafka bar wuxuu matalaa celceliska + SEM ee lix deeq-bixiye caafimaad qaba. Wuxuu matalaa xogta laga helay ugu yaraan n = 3 tijaabo oo madax-bannaan. (B ilaa D) CD3/CD28 iyo IL-2 waxaa loo isticmaalay in lagu dhaqaajiyo unugyada T ee ku urursan MNA-dooda muddo 7 maalmood ah. Kahor falanqaynta, unugyada waxaa lagu kiciyay PMA/ionomycin oo leh GolgiStop muddo 4 saacadood ah. Muujinta TNFα (B) ee unugyada T. Sawirka tusaalaha ah (bidix) iyo xogta shaxda (midig) ee muujinta TNFα ee unugyada nool. Muujinta IFN-γ (C) iyo IL-2 (D) ee unugyada T. Muujinta cytokines-ka waxaa lagu cabiray cytometry socodka. Garaafka bar wuxuu matalaa celceliska (n = 6 deeq-bixiye caafimaad qaba) + SEM. Isticmaal falanqaynta hal-dhinac ee kala duwanaanshaha iyo cabbiraadaha soo noqnoqda (*P<0.05 iyo **P<0.01) si loo go'aamiyo qiimaha P. Waxay matashaa xogta laga helay ugu yaraan n = 3 tijaabooyin madax-bannaan. (E ilaa G) CD3/CD28 iyo IL-2 ayaa loo isticmaalay in lagu dhaqaajiyo unugyada T ee ku urursan MNA-dooda muddo 7 maalmood ah. Qalabka waxaa la ururiyay ka hor iyo ka dib 4 saacadood oo kicinta PMA/ionomycin ah. Fiirsashada TNFα (E), IFN-γ (F) iyo IL-2 (G) waxaa lagu cabbiray ELISA. Garaafka bar wuxuu matalaa celceliska (n = 5 deeq-bixiye caafimaad qaba) + SEM. Qiimaha P waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la adeegsanayo falanqaynta hal-dhinac ah ee kala duwanaanshaha iyo cabbiraadaha soo noqnoqda (*P<0.05). Khadadka dhibcaha leh waxay muujinayaan xadka ogaanshaha ee ogaanshaha. (H) Baaritaanka lysis-ka unugyada. Unugyada FRα-CAR-T ama GFP-CAR-T waxaa lagu hagaajiyay adenosine (250μM) ama MNA (10 mM) muddo 24 saacadood ah, ama aan la daaweyn (Ctrl). Boqolleyda dilka unugyada SK-OV-3 ayaa la cabbiray. Qiimaha P waxaa lagu go'aamiyay tijaabada Welch t (*P<0.5 iyo **P<0.01).
Si loo helo faham farsamo oo ku saabsan nidaaminta muujinta TNFα ee ku tiirsan MNA, isbeddellada ku yimid mRNA-da TNFα ee unugyada T ee lagu daweeyay MNA ayaa la qiimeeyay (Jaantuska 5A). Unugyada T ee deeq-bixiyeyaasha caafimaadka qaba ee lagu daweeyay MNA waxay muujiyeen koror laba jibaar ah oo ku yimid heerarka qoraalka TNFα, taasoo muujinaysa in MNA ay ku tiirsan tahay nidaaminta qoraalka TNFα. Si loo baaro habkan sharciyeynta ee suurtogalka ah, laba arrimood oo qoraal ah oo la yaqaan oo nidaamiya TNFα, kuwaas oo kala ah qodobka nukliyeerka unugyada T ee firfircoon (NFAT) iyo borotiinka gaarka ah 1 (Sp1), ayaa la qiimeeyay iyadoo laga jawaabayo ku xidhnaanta MNA ee kor u qaadayaasha TNFα ee u dhow (30). Horumariyaha TNFα wuxuu ka kooban yahay 6 goobood oo isku xidha NFAT iyo 2 goobood oo isku xidha Sp1, oo isku dul saaran hal goob [-55 lammaane oo saldhig ah (bp) laga bilaabo 5'cap] (30). Chromatin immunoprecipitation (ChIP) waxay muujisay in marka lagu daaweeyo MNA, ku xidhnaanta Sp1 ee kor u qaadayaasha TNFα ay saddex jibaar kor u kacday. Ku darista NFAT sidoo kale way korodhay oo waxay soo dhawaatay muhiimadda (Jaantuska 5B). Xogtani waxay muujinaysaa in MNA ay nidaamiso muujinta TNFα iyada oo loo marayo qoraalka Sp1, iyo ilaa xad ka yar muujinta NFAT.
(A) Marka la barbardhigo unugyada T ee lagu beeray MNA la'aanteed, isbeddelka laablaabashada muujinta TNFα ee unugyada T ee lagu daaweeyay MNA. Qaabka muujinta ee SEM ayaa la muujiyay (n = 5 deeq-bixiyeyaal caafimaad qaba). Waxay matashaa xog laga helay ugu yaraan n = 3 tijaabo oo madax-bannaan. (B) Horumariyaha TNFα ee unugyada T ee lagu daaweeyay ama aan lahayn 8 mM MNA ka dib NFAT iyo Sp1 waxaa lagu daray kicinta (Ctrl) iyo PMA/ionomycin muddo 4 saacadood ah. Immunoglobulin G (IgG) iyo H3 waxaa loo isticmaalay xakamaynta taban iyo togan ee difaaca jirka, siday u kala horreeyaan. Tirada ChIP waxay muujisay in isku xidhka Sp1 iyo NFAT ee kor u qaadayaasha TNFα ee unugyada lagu daaweeyay MNA ay kordheen dhowr jeer marka la barbar dhigo xakamaynta. Waxay matashaa xogta laga helay ugu yaraan n = 3 tijaabo oo madax-bannaan. Qiimaha P waxaa go'aamiyay baaritaanno badan oo t ah (*** P <0.01). (C) Marka la barbardhigo ascites-ka HGSC, unugyada T (aan sun ahayn) waxay muujiyeen muujinta korodhka TNF ee burooyinka. Midabadu waxay matalaan bukaanno kala duwan. Unugyada la soo bandhigay waxaa si aan kala sooc lahayn loogu qaaday 300 waxaana la shiiday si loo xaddido xad-dhaafka (** Padj = 0.0076). (D) Qaabka la soo jeediyay ee MNA ee kansarka ugxan-sidaha. MNA waxaa lagu soo saaraa unugyada burooyinka iyo fibroblasts-ka ee TME waxaana qaata unugyada T. MNA waxay kordhisaa isku xidhka Sp1 ee kor u qaadayaasha TNFα, taasoo horseedaysa kordhinta qorista TNFα iyo wax soo saarka cytokine-ka TNFα. MNA waxay sidoo kale keentaa hoos u dhac ku yimaada IFN-γ. Joojinta shaqada unugyada T waxay horseedaa hoos u dhaca awoodda dilka iyo kobaca burooyinka oo degdega ah.
Sida laga soo xigtay warbixinnada, TNFα waxay leedahay saameyn ka hortagta burooyinka iyo ka hortagga burooyinka oo hore iyo gadaalba ku tiirsan, laakiin waxay leedahay door caan ah oo ku saabsan kor u qaadista koritaanka iyo metastasis-ka kansarka ugxan-sidaha (31-33). Sida laga soo xigtay warbixinnada, fiirsashada TNFα ee unugyada burooyinka ee bukaanada qaba kansarka ugxan-sidaha ayaa ka sarreeya kan unugyada aan fiicnayn (34-36). Marka la eego farsamada, TNFα waxay nidaamin kartaa kicinta, shaqada iyo faafitaanka unugyada dhiigga cad, waxayna beddeli kartaa nooca unugyada kansarka (37, 38). Iyadoo la raacayo natiijooyinkan, falanqaynta muujinta hidda-wadaha kala duwan waxay muujisay in TNF si weyn loogu hagaajiyay unugyada T ee unugyada burooyinka marka la barbar dhigo ascites (Jaantuska 5C). Kordhinta muujinta TNF waxay ka muuqatay oo keliya dadka unugyada T ee leh nooca aan sunta ahayn (Jaantuska S5A). Marka la soo koobo, xogtani waxay taageertaa aragtida ah in MNA ay leedahay laba saameyn oo difaac ah iyo kor u qaadida burooyinka ee HGSC.
Calaamadaynta iftiinka leh ee ku salaysan cytometry socodka ayaa noqotay habka ugu weyn ee lagu barto dheef-shiid kiimikaadka TIL. Daraasadahani waxay muujiyeen in marka la barbardhigo lymphocytes-ka dhiigga ee durugsan ama unugyada T ee ka yimaada xubnaha lymphoid-ka labaad, murine iyo TIL-ka aadanaha ay leeyihiin u janjeera sare oo ah inay qaataan gulukooska (4, 39) iyo luminta tartiib tartiib ah ee shaqada mitochondrial (19, 40). Inkasta oo aan ku aragnay natiijooyin isku mid ah daraasaddan, horumarka muhiimka ah waa in la barbar dhigo dheef-shiid kiimikaadka unugyada burooyinka iyo TIL ee isla unugyada burooyinka ee la jaray. Iyadoo la raacayo qaar ka mid ah warbixinnadan hore, unugyada burooyinka (CD45-EpCAM +) ee ka yimaada ascites iyo burooyinka waxay leeyihiin qaadashada gulukooska oo ka sarreysa unugyada CD8 + iyo CD4 + T, taasoo taageeraysa in qaadashada gulukooska sare ee unugyada burooyinka la barbar dhigi karo unugyada T. Fikradda tartanka unugyada T. TME. Si kastaba ha ahaatee, dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee unugyada burooyinka ayaa ka sarreeya kan unugyada CD8 + T, laakiin dhaqdhaqaaqa mitochondrial wuxuu la mid yahay kan unugyada CD4 + T. Natiijooyinkani waxay xoojinayaan mawduuca soo baxaya ee ah in dheef-shiid kiimikaadka oksaydhku uu muhiim u yahay unugyada burooyinka (41, 42). Waxay sidoo kale soo jeedinayaan in unugyada CD8 + T ay u nugul yihiin shaqada oksaydhka marka loo eego unugyada CD4 + T, ama in unugyada CD4 + T ay isticmaali karaan ilo kaarboon ah oo aan ahayn gulukooska si ay u ilaaliyaan dhaqdhaqaaqa mitochondrial (43, 44). Waa in la ogaadaa inaanan arag wax farqi ah oo ku saabsan qaadashada gulukooska ama dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee u dhexeeya CD4 + T effectors, xusuusta T effector iyo unugyada xusuusta dhexe ee T ee ascites. Sidoo kale, xaaladda kala duwanaanshaha unugyada CD8 + T ee burooyinka wax xiriir ah lama lahan isbeddellada qaadashada gulukooska, taasoo muujinaysa farqiga weyn ee u dhexeeya unugyada T ee lagu beeray in vitro iyo TIL aadanaha in vivo (22). Indha-indheyntan waxaa sidoo kale lagu xaqiijiyay isticmaalka qaybinta tirada unugyada otomaatiga ah ee aan eex lahayn, taas oo sii shaaca ka qaaday in unugyada CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + oo leh qaadashada gulukooska oo ka sarreeya iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial marka loo eego unugyada burooyinka ay ku badan yihiin laakiin ay leeyihiin tirada unugyada firfircoon ee Metabolic. Dadkani waxay matali karaan tirada dadka ee la soo bandhigay ee unugyada xakamaynta myeloid ama unugyada dendritic plasmacytoid ee lagu aqoonsaday falanqaynta scRNA-seq. In kasta oo labadan lagu soo warramey burooyinka ugxan-sidaha ee aadanaha [45], haddana wali waxay u baahan yihiin shaqo dheeraad ah waa in lagu qeexo tiradan yar ee myeloid-ka.
In kasta oo hababka ku salaysan socodka cytometry ay caddayn karaan kala duwanaanshaha guud ee dheef-shiid kiimikaadka gulukooska iyo oksaydhka ee u dhexeeya noocyada unugyada, haddana dheef-shiid kiimikaadka saxda ah ee ay soo saaraan gulukooska ama ilo kale oo kaarboon ah oo loogu talagalay dheef-shiid kiimikaadka mitochondrial ee TME weli lama go'aamin. U qoondaynta joogitaanka ama maqnaanshaha metabolites-ka qayb-hoosaad TIL ah waxay u baahan tahay nadiifinta tirada unugyada laga soo saaray unugyada la saaray. Sidaa darteed, habkayaga kobcinta unugyada oo ay weheliso spectrometry-ga cufnaanta ayaa bixin kara aragtiyo ku saabsan metabolites-ka si kala duwan ugu hodansan unugyada T iyo dadka unugyada burooyinka ee muunadaha bukaanka ee isku midka ah. Inkasta oo habkani uu leeyahay faa'iidooyin ka badan kala-soocidda unugyada firfircoon ee fluorescence, maktabadaha metabolite-ka qaarkood ayaa laga yaabaa inay saameeyaan xasilloonida gudaha iyo/ama heerka isbeddelka degdegga ah (22). Si kastaba ha ahaatee, habkayagu wuxuu awooday inuu aqoonsado laba metabolites oo la aqoonsan yahay oo difaaca jirka joojiya, adenosine iyo kynurenine, sababtoo ah waxay si weyn ugu kala duwan yihiin noocyada muunadaha.
Falanqayntayada dheef-shiid kiimikaadka ee burooyinka iyo noocyada hoose ee TIL waxay bixisaa aragtiyo badan oo ku saabsan doorka metabolites-ka ee TME-ga ugxan-sidaha. Marka hore, annagoo adeegsanayna cytometry socodka, waxaan go'aansanay inaysan jirin wax farqi ah oo ku yimid dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee u dhexeeya burooyinka iyo unugyada CD4 + T. Si kastaba ha ahaatee, falanqaynta LC-MS/MS waxay muujisay isbeddello muhiim ah oo ku yimid tirada metabolites-ka ee dadkan, taasoo muujinaysa in gunaanadka ku saabsan dheef-shiid kiimikaadka TIL iyo hawlihiisa dheef-shiid kiimikaadka guud ay u baahan yihiin fasiraad taxaddar leh. Marka labaad, MNA waa metabolite-ka leh farqiga ugu weyn ee u dhexeeya unugyada CD45-ka iyo unugyada T-ga ee ascites-ka, ee maaha burooyinka. Sidaa darteed, kala-qaybsanaanta iyo goobta burooyinka waxay yeelan karaan saameyn kala duwan oo ku saabsan dheef-shiid kiimikaadka TIL, taas oo iftiiminaysa kala-duwanaanshaha suurtagalka ah ee jawi yar oo la bixiyay. Saddexaad, muujinta enzyme-ka soo saara MNA NNMT waxaa inta badan ku kooban CAF, kaas oo ah unugyada burooyinka ilaa xad yar, laakiin heerarka MNA ee la ogaan karo ayaa lagu arkay unugyada T-ga ee burooyinka laga helo. Muujinta xad-dhaafka ah ee NNMT ee ugxan-sidaha CAF waxay leedahay saameyn la yaqaan oo kor u qaadaysa kansarka, qayb ahaan sababtoo ah kor u qaadista dheef-shiid kiimikaadka CAF, duullaanka burooyinka iyo metastasis (27). In kasta oo heerka guud ee TIL uu yahay mid dhexdhexaad ah, muujinta NNMT ee CAF waxay si dhow ula xiriirtaa nooca mesenchymal ee Kansarka Genome Atlas (TCGA), kaas oo lala xiriiriyo saadaalin liidata (27, 46, 47). Ugu dambeyntii, muujinta enzyme-ka AOX1 ee mas'uulka ka ah burburka MNA sidoo kale waxay ku kooban tahay dadka CAF, taas oo tilmaamaysa in unugyada T aysan lahayn awood ay ku dheefshiidaan MNA. Natiijooyinkani waxay taageerayaan fikradda ah in kasta oo loo baahan yahay shaqo dheeraad ah si loo xaqiijiyo natiijadan, haddana heerarka sare ee MNA ee unugyada T waxay muujin karaan jiritaanka jawi yar oo CAF ah oo difaaca jirka hoos u dhigaya.
Marka la eego heerka muujinta hoose ee gaadiidka MNA iyo heerarka aan la ogaan karin ee borotiinnada muhiimka ah ee ku lug leh dheef-shiid kiimikaadka MNA, joogitaanka MNA ee unugyada T waa lama filaan. NNMT iyo AOX1 midna laguma ogaan karo falanqaynta scRNA-seq iyo qPCR-ka bartilmaameedka ah ee laba kooxood oo madax-bannaan. Natiijooyinkani waxay muujinayaan in MNA aan lagu soo saarin unugyada T, laakiin laga nuugo TME ku xeeran. Tijaabooyinka In vitro waxay muujinayaan in unugyada T ay u muuqdaan inay ururiyaan MNA dibadda ah.
Daraasaddeenna ku saabsan unugyada ayaa muujisay in MNA-ga dibadda ah uu kiciyo muujinta TNFα ee unugyada T isla markaana uu xoojiyo isku xidhka Sp1 ee kor u qaada TNFα. Inkasta oo TNFα uu leeyahay labadaba shaqooyinka ka hortagga burooyinka iyo ka hortagga burooyinka, kansarka ugxan-sidaha, TNFα waxay kor u qaadi kartaa koritaanka kansarka ugxan-sidaha (31-33). Dhexdhexaadinta TNFα ee dhaqanka unugyada burooyinka ugxan-sidaha ama ka saarista calaamadda TNFα ee moodooyinka jiirka ayaa hagaajin kara wax soo saarka cytokine-ka bararka ee TNFα oo xannibi kara koritaanka burooyinka (32, 35). Sidaa darteed, kiiskan, MNA-ga laga soo qaatay TME wuxuu u dhaqmi karaa sidii metabolite pro-barar ah iyada oo loo marayo farsamo ku tiirsan TNFα iyada oo loo marayo wareegga autocrine, taasoo kor u qaadaysa dhacdada iyo faafitaanka kansarka ugxan-sidaha (31). Iyada oo ku saleysan suurtagalnimadan, xannibaadda TNFα waxaa lagu darayaa sidii wakiil daaweyn oo suurtagal ah oo loogu talagalay kansarka ugxan-sidaha (37, 48, 49). Intaa waxaa dheer, MNA waxay wax u dhimaysaa sunta unugyada CAR-T ee unugyada burooyinka ugxan-sidaha, iyadoo bixinaysa caddayn dheeraad ah oo loogu talagalay xakamaynta difaaca jirka ee MNA. Guud ahaan, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan qaab ay burooyinka iyo unugyada CAF ay MNA ugu soo saaraan TME-ga ka baxsan xuubka. Iyada oo loo marayo (i) kicinta koritaanka kansarka ugxan-sidaha ee TNF ay keento iyo (ii) joojinta dhaqdhaqaaqa sunta ah ee unugyada T ee MNA ay keento, tani waxay yeelan kartaa saameyn labanlaab ah oo burooyinka ah (Jaantuska 5D).
Gunaanad ahaan, iyadoo la adeegsanayo isku-darka kobcinta unugyada degdegga ah, isku-xigxiga hal-unug iyo qaab-dhismeedka dheef-shiid kiimikaadka, daraasaddani waxay muujisay farqiga weyn ee immunometabolomik ee u dhexeeya burooyinka iyo unugyada ascites ee bukaanada HGSC. Falanqayntan dhammaystiran waxay muujisay in ay jiraan kala duwanaansho ku saabsan qaadashada gulukooska iyo dhaqdhaqaaqa mitochondrial ee u dhexeeya unugyada T, waxayna aqoonsatay MNA inay tahay metabolite nidaamiya difaaca jirka ee aan unugyada ahayn. Xogtani waxay saameyn ku leedahay sida TME u saamayso dheef-shiid kiimikaadka unugyada T ee kansarka aadanaha. Inkasta oo la soo sheegay tartanka tooska ah ee nafaqooyinka u dhexeeya unugyada T iyo unugyada kansarka, metabolites-ku waxay sidoo kale u dhaqmi karaan sidii nidaamiyayaal aan toos ahayn si kor loogu qaado horumarka burooyinka iyo suurtogalnimada in la xakameeyo jawaabaha difaaca jirka ee asalka ah. Sharaxaadda dheeraadka ah ee doorka shaqo ee metabolites-yadan nidaamiya waxay furi kartaa xeelado kale oo lagu xoojinayo jawaabta difaaca jirka ee ka hortagga burooyinka.
Shaybaarada bukaanka iyo xogta kiliinikada waxaa laga helay keydka unugyada kansarka ee BC oo ay shahaadeysay Shabakadda Kaydinta Tissue ee Kanada. Sida ku cad hab-maamuuska ay ansixisay Guddiga Anshaxa Cilmi-baarista Kansarka ee BC iyo Jaamacadda British Columbia (H07-00463), dhammaan muunadaha bukaanada iyo xogta kiliinikada waxay heleen ogolaansho qoraal ah oo la wargeliyay ama si rasmi ah ayay uga tanaasuleen ogolaanshahooda. Shaybaarada waxaa lagu kaydiyaa BioBank-ka shahaadaysan (BRC-00290). Astaamaha bukaanka ee faahfaahsan waxaa lagu muujiyay Jadwalka S1 iyo S5. Kaydinta cryopreservation, muunad scalpel ah ayaa loo isticmaalaa in si farsamo ahaan loo burburiyo muunadda burooyinka bukaanka ka dibna lagu riixo shaandhada 100-micron si loo helo hal joojin unug. Ascites-ka bukaanka waxaa lagu centrifugeeeyay 1500 rpm muddo 10 daqiiqo ah heerkul ah 4°C si loo nuugo unugyada loona saaro dheecaanka. Unugyada laga helay burooyinka iyo ascites-ka waxaa lagu kaydiyay 50% serum-ka AB-ga aadanaha ee kulaylka-ku-shaqaysta (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) iyo 10% dimethyl sulfoxide. Joojinta unugyada hal-halka ah ee la ilaaliyay ayaa la dhalaaliyay waxaana loo isticmaalay go'aaminta dheef-shiid kiimikaadka iyo metabolite-ka ee hoos lagu sharraxay.
Qalabka dhammaystiran wuxuu ka kooban yahay 0.22 μm oo la sifeeyay 50:50 RPMI 1640 oo lagu daray: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) oo lagu daray 10% serum human AB oo kuleyl-kicin ah (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x xal Penicillin Streptomycin (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) iyo 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) waxaa lagu kabay 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) iyo 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Qalabka nadiifinta ee socodka cytometer-ka wuxuu ka koobnaa 0.22μm oo la sifeeyay oo ah saline fosfate ah oo la sifeeyay (PBS; Invitrogen) oo lagu kabay 3% serum human AB oo kuleyl-kicin ah (Sigma). Kaydka kobcinta unugyada wuxuu ka kooban yahay 0.22μm PBS oo la sifeeyay waxaana lagu kabay 0.5% serum AB-ga aadanaha ee kulaylka-kicinta leh (Sigma-Aldrich).
Heerkulka dhammaystiran ee 37°C, unugyada waxaa lagu rinjiyeeyay 10 nM MT DR iyo 100 μM 2-NBDG muddo 30 daqiiqo ah. Marka xigta, unugyada waxaa lagu rinjiyeeyay midab firfircooni leh eF506 heerkul ah 4°C muddo 15 daqiiqo ah. Dib ugu celi unugyada FC Block (eBioscience) iyo Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), ku qasi qalabka rinjiyeynta socodka cytometer (sida waafaqsan tilmaamaha soo saaraha), oo ku kululee 10 daqiiqo heerkulka qolka. Unugyada ku rinjiyeeya unugyo difaac ah (Jadwalka S2) oo ku jira qalabka rinjiyeynta socodka cytometry heerkul ah 4°C muddo 20 daqiiqo ah. Dib ugu celi unugyada qalabka rinjiyeynta socodka cytometry (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R habaynta) ka hor falanqaynta. Isticmaal SpectroFlo iyo FlowJo V10 si aad u falanqayso xogta tirada unugyada, oo isticmaal GraphPad Prism 8 si aad u abuurto xogta. Xoogga iftiinka dhexdhexaadka ah (MFI) ee 2-NBDG iyo MT DR ayaa la beddelay diiwaanka, ka dibna tijaabo t oo lammaane ah ayaa loo isticmaalay falanqaynta tirakoobka si loogu xisaabiyo bukaanada la midka ah. Ka saar dhammaan dadka leh wax ka yar 40 dhacdo falanqaynta; geli qiimaha MFI ee 1 qiimayaal taban ka hor intaadan sameynin falanqaynta tirakoobka iyo muuqaalka xogta.
Si aan u kabo istaraatiijiyadda marin-habaabinta gacanta ee guddiga habka kor ku xusan, waxaan isticmaalnay sharraxaadda buuxda ee geedka xaddidaadda qaabka (FAUST) (21) si aan si toos ah ugu qoondeyno unugyada dadka ka dib markii aan ka saarno unugyada dhintay ee FlowJo. Waxaan gacanta ku maamulnaa wax soo saarka si aan isugu darno dadka u muuqda in si khaldan loo qoondeeyay (isku-darka PD1+ unugyada burooyinka PD1) iyo dadka la hayo. Muunad kasta waxay ka kooban tahay celcelis ahaan in ka badan 2% unugyo, wadarta guud ee 11 qof.
Centrifugation cufnaanta kala-soocidda Ficoll ayaa loo isticmaalay in lagu kala saaro PBMC iyo alaabada kala-soocidda leukocyte (STEMCELL Technologies). Unugyada CD8 + T waxaa laga soocay PBMC iyadoo la adeegsanayo CD8 MicroBeads (Miltenyi) waxaana lagu ballaariyay dhexdhexaad dhammaystiran iyadoo la adeegsanayo TransAct (Miltenyi) muddo 2 toddobaad ah sida ku cad tilmaamaha soo saaraha. Unugyada waxaa loo oggolaaday inay istaagaan muddo 5 maalmood ah oo ku jira dhexdhexaad dhammaystiran oo ay ku jiraan IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), ka dibna dib loogu kiciyo TransAct. Maalintii 7aad, sida ku cad tilmaamaha soo saaraha, CD45 MicroBeads (Miltenyi) oo bini'aadan ah ayaa loo isticmaalay in lagu kobciyo unugyada saddex wareeg oo isku xiga. Unugyada waxaa loo kala saaray falanqaynta socodka cytometry (sida kor lagu sharaxay), hal milyan oo unugna waxaa loo kala saaray saddex jeer falanqaynta LC-MS/MS. Muunadaha waxaa farsameeyay LC-MS/MS sida hoos lagu sharaxay. Waxaan ku qiyaasnay ​​qiimaha metabolite-ka maqan tiro ion ah oo ah 1,000. Muunad kasta waxaa lagu caadiyeeyaa wadarta tirada ion-ka (TIC), si logarithm ah ayaa loo beddelaa oo si toos ah ayaa loogu caadiyeeyaa MetaboAnalystR ka hor falanqaynta.
Hal-ku-dhegga hal-ku-dhegga ee bukaan kasta waa la dhalaaliyay oo lagu sifeeyay shaandho 40 μm ah oo loo beddelay mid dhammaystiran (sida kor lagu sharaxay). Sida ku cad hab-raaca soo saaraha, saddex wareeg oo isku xiga oo xulasho togan ah oo lagu kala saarayo unugyada magnetic iyadoo la adeegsanayo MicroBeads (Miltenyi) ayaa loo isticmaalay in lagu kobciyo muunadaha unugyada CD8+, CD4+ iyo CD45- (barafka). Marka la soo koobo, unugyada waxaa dib loogu celiyaa kaydka kobcinta unugyada (sida kor lagu sharaxay) oo la tiriyaa. Unugyada waxaa lagu kululeeyay ul CD8 bini'aadam, ul CD4 bini'aadam ama ul CD45 bini'aadam (Miltenyi) heerkul ah 4°C muddo 15 daqiiqo ah, ka dibna waxaa lagu dhaqay kaydka kobcinta unugyada. Muunadda waxaa loo mariyay tiirka LS (Miltenyi), jajabyada togan iyo kuwa taban ayaa la ururiyaa. Si loo yareeyo muddada loona kordhiyo tallaabada soo kabashada unugyada, jajabka CD8 ayaa markaa loo isticmaalaa wareegga labaad ee kobcinta CD4+, jajabka CD4-na waxaa loo isticmaalaa kobcinta CD45-ka xiga. Xalka ku hay baraf inta lagu jiro habka kala-goynta.
Si loo diyaariyo muunado loogu talagalay falanqaynta dheef-shiid kiimikaadka, unugyada waxaa hal mar lagu dhaqay xal milix baraf ah, ka dibna 1 ml oo ah 80% methanol ayaa lagu daray muunad kasta, ka dibna waxaa lagu shubay oo lagu qaboojiyey nitrogen dareere ah. Muunado waxaa lagu sameeyay saddex wareeg oo barafoobay oo lagu dhalaaliyay 14,000 rpm muddo 15 daqiiqo ah heerkul ah 4°C. Dusha sare ee ka kooban dheef-shiid kiimikaadka ayaa la uumi-bixiyaa ilaa ay ka qallalaan. Dheelitirka waxaa dib loogu milmay 50 μl oo ah 0.03% aashitada formic, lagu shubay si loogu qaso, ka dibna lagu shubay si looga saaro qashinka.
Soo saar metabolites-ka sida kor lagu sharaxay. Ku wareeji substrate-ka dhalo dareere ah oo tayo sare leh si loo sameeyo cilmi-baaris dheef-shiid kiimikaad. Isticmaal hab-raac daaweyn oo aan kala sooc lahayn si aad muunad kasta ugu daaweyso tiro unugyo ah oo la mid ah si looga hortago saameynta dufcadda. Waxaan sameynay qiimeyn tayo leh oo ku saabsan metabolites-ka caalamiga ah ee hore loogu daabacay AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Falanqaynta Chromatographic-ga iyo isku-darka aagga ugu sarreeya waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo software-ka MultiQuant nooca 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Tiro ion ah oo ah 1000 ayaa loo isticmaalay in lagu qiyaaso qiimaha dheef-shiid kiimikaadka maqan, TIC-ga muunad kastana waxaa loo isticmaalay in lagu xisaabiyo aagga ugu sarreeya ee caadiga ah ee metabolite kasta oo la ogaado si loo saxo isbeddellada ay soo bandhigtay falanqaynta qalabka ee ka timid habka muunadda. Ka dib marka TIC la caadiyeeyo, MetaboAnalystR(51) (beegga caadiga ah) ayaa loo isticmaalaa beddelka logarithmic iyo cabbirka xariiqda caadiga ah ee otomaatiga ah. Waxaan isticmaalnay PCA oo leh baakad vegan R ah si aan u sameyno falanqayn sahaminta ah oo ku saabsan kala duwanaanshaha dheef-shiid kiimikaadka ee u dhexeeya noocyada muunadda, waxaanan isticmaalnay falanqayn qayb ahaan ah si aan u falanqayno bukaanada. Isticmaal habka Ward si aad u dhisto dendrogram khariidadda kulaylka si aad u ururiso masaafada Euclidean ee u dhaxaysa muunadaha. Waxaan u isticmaalnay limma (52) tirada metabolite-ka ee caadiga ah si aan u aqoonsanno metabolite-yada kala duwan ee tirada badan ee ku baahsan dhammaan nooca unugyada iyo deegaanka yar. Si loo fududeeyo sharraxaadda, waxaan isticmaalnaa halbeegga celceliska kooxda si aan u qeexno qaabka, oo aan u tixgelinno noocyada unugyada ee deegaanka yar koox kasta (n = 6 kooxood); Tijaabada muhiimadda, waxaan sameynay saddex cabbir oo soo noqnoqda oo loogu talagalay metabolite kasta. Si looga fogaado nuqul been ah, bukaanka waxaa lagu daray caqabad ku ah naqshadda limma. Si loo hubiyo kala duwanaanshaha metabolites-ka ee u dhexeeya bukaanada kala duwan, waxaan u hagaajinay qaabka limma oo ay ku jiraan bukaanada si go'an. Waxaan soo sheegaynaa muhiimadda isbarbardhigga hore loo cayimay ee u dhexeeya nooca unugyada iyo deegaanka yar ee Padj <0.05 (saxitaanka Benjamin-Hochberg).
Ka dib markii la kobciyay firfircoonida iyadoo la adeegsanayo Qalabka Ka saarista Unugyada Dhimatay ee Miltenyi (>80% noolaanshaha), taxanaha transcriptome-ka hal-unug ayaa lagu sameeyay wadarta guud ee ascites-ka nool ee la qaboojiyey iyo muunadaha burooyinka iyadoo la adeegsanayo hab-raaca muujinta hidda-wadaha 10x 5′. Shan kiis oo leh burooyinka isku midka ah iyo ascites ayaa la falanqeeyay, inkastoo heerka hoose ee suurtogalnimada hal muunad buro ah ay ka hortagtay ku darista. Si loo gaaro xulashooyin badan oo bukaanno ah, waxaan isku darnay muunado bukaan kasta oo ku jira dariiqyada kontoroolka chromium-ka 10x, waxaanan si gaar ah u falanqaynay ascites-ka iyo goobaha burooyinka. Ka dib markii la isku xigxigay [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp dhammaadka isku xiran (PE), genome-ka Quebec; Celcelis ahaan 73,488 iyo 41,378 akhris unug kasta oo loogu talagalay burooyinka iyo ascites siday u kala horreeyaan]], waxaan u isticmaalnay CellSNP iyo Vireo (53) (iyadoo lagu saleynayo CellSNP sida SNP-ga caadiga ah ee aadanaha (VCF) ee ay bixiso GRCh38 waxaa loo qoondeeyay aqoonsi deeq-bixiye. Waxaan u isticmaalnaa SNPRelate si aan u ogaano aqoonsiga ugu dhow (IBS) ee xaaladda hidde-sidaha bukaanka (IBS), marka laga reebo unugyada aan la qoondeyn iyo unugyada loo aqoonsaday inay yihiin laba-laab iyo deeq-bixiyeyaasha isku midka ah ee u dhexeeya ascites iyo muunadaha burooyinka (54). Iyada oo ku saleysan hawshan, waxaan haynay saddex kiis oo leh matalaad unug oo badan oo ku jirta burooyinka iyo ascites si loo falanqeeyo hoos. Ka dib markii aan sameynay tallaabo sifeyn ballaaran oo ku jirta baakadaha kala-baxa (55) iyo scran (56) BioConductor, tani waxay soo saartay 6975 unug (2792 iyo 4183 unug oo ka yimid burooyinka iyo ascites, siday u kala horreeyaan) falanqaynta. Waxaan u isticmaalnaa isku-darka igraph (57) ee shabakadda deriska ee ugu dhow ee la wadaago (SNN) iyadoo lagu saleynayo masaafada Jaccard Unugyada kooxda iyadoo loo eegayo muujinta. Kooxuhu waxaa gacanta lagu sharraxay noocyada unugyada ee la soo bandhigay iyadoo lagu saleynayo muujinta hidda-wadaha calaamadeysan waxaana lagu sawiray t-SNE. Unugyada T-ga ee sunta ah waxaa lagu qeexaa muujinta CD8A iyo GZMA, marka laga reebo kooxo-hoosaadyo leh muujinta borotiinka ribosomal oo hooseeya. Waxaan galnay xogta la daabacay ee Izar et al. (16), oo ay ku jiraan ku-xidhnaantooda t-SNE, waxay xakamayn kartaa isku-dhafka muujinta ee u dhexeeya calaamadaha unugyada difaaca jirka iyo muujinta NNMT.
PBMC waxaa laga soocay alaabada kala soocidda leukocyte (STEMCELL Technologies) iyadoo la adeegsanayo centrifugation-ka cufnaanta gradient Ficoll. Unugyada CD3 + waxaa laga soocay PBMC iyadoo la adeegsanayo kuul CD3 (Miltenyi). Joogitaanka ama maqnaanshaha MNA, unugyada CD3+ waxaa lagu hawlgeliyay CD3-taarikada ku xiran (5μg/ml), CD28 milmi kara (3μg/ml) iyo IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Maalintii ugu dambeysay ee ballaarinta, jiritaanka (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) iyo faafinta (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) waxaa lagu qiimeeyay cytometry socodka. Qiimee shaqada saamaynta adigoo kicinaya unugyada leh PMA (20 ng/ml) iyo ionomycin (1μg/ml) oo leh GolgiStop muddo 4 saacadood ah, oo la soco CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) iyo TNFα-fluorescein isothiocyanate (FITC) (MAb11, BD). Kici unugyada qPCR iyo Chip iyagoo wata PMA (20 ng/ml) iyo ionomycin (1μg/ml) muddo 4 saacadood ah. ELISA supernatant waxaa la ururiyay ka hor iyo ka dib kicinta iyadoo la adeegsanayo PMA (20 ng/ml) iyo ionomycin (1 μg/ml) muddo 4 saacadood ah.
Raac hab-maamuuska soo saaraha si aad u kala soocdo RNA adoo isticmaalaya RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Isticmaal QIAshredder (QIAGEN) si aad u mideyso muunadda. Isticmaal RNA awood sare leh oo ku socota qalabka cDNA (Thermo Fisher Scientific) si aad u sameyso DNA-da dhameystiran (cDNA). Isticmaal TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) si aad u qiyaasto muujinta hidda-wadaha (sida waafaqsan hab-maamuuska soo saaraha) oo leh baaritaannada soo socda: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] iyo Hs01010726_m1 (SLC22A2). Shaybaarrada waxaa lagu sameeyay nidaamka PCR-ka waqtiga-dhabta ah ee StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) ee saxanka falcelinta ee MicroAmp ee degdega ah ee 96-cell optical (Applied Biosystems) oo leh filimka indhaha ee MicroAmp. Qiimo kasta oo Ct ah oo ka badan 35 waxaa loo arkaa inuu ka sarreeyo heerka ogaanshaha waxaana loo calaamadeeyay mid aan la ogaan karin.
Samee ChIP sidii hore loogu sharraxay (58). Marka la soo koobo, unugyada waxaa lagu daaweeyay formaldehyde (fiirsashada ugu dambeysa 1.42%) waxaana lagu kululeeyay heerkulka qolka muddo 10 daqiiqo ah. Isticmaal kayd barar ah oo dheeri ah (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl iyo 0.1% NP-40) baraf 10 daqiiqo, ka dibna dib ugu celi kaydka difaaca jirka sida lagu sharaxay (58). Muunadda waxaa markaa lagu daray wareegyada soo socda: 10 wareeg (20 garaac 1-ilbiriqsi) iyo waqti go'an oo ah 40 ilbiriqsi. Ku dar unugyada difaaca jirka ee heerka ChIP-ga ah ee immunoglobulin G (Tiknoolajiyadda Calaamadaha Unugyada; 1μl), histone H3 (Tiknoolajiyadda Calaamadaha Unugyada; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) iyo SP1 (Tiknoolajiyadda Calaamadaha Unugyada; 3μl) iyadoo muunadda lagu ruxayo 4°CC habeenkii. Ku shub borotiinka A (Thermo Fisher Scientific) oo muunadda ku hay 4°C adigoo si tartiib ah u ruxaya muddo 1 saac ah, ka dibna isticmaal chelex kuul (Bio-Rad) si aad u kobciso DNA-da, oo isticmaal proteinase K (Thermo Fisher) si aad u dheefsato borotiinka. Horumariyaha TNFα waxaa lagu ogaaday PCR: hore, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; lidkeeda, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp wax soo saar). Sawirrada waxaa soo saaray Image Lab (Bio-Rad) waxaana lagu qiyaasaa iyadoo la adeegsanayo software-ka ImageJ.
Ka-soo-baxa dhaqanka unugyada ayaa la soo ururiyay sida kor lagu sharaxay. Go'aaminta waxaa lagu sameeyay iyadoo la raacayo hababka soo saaraha ee qalabka TNFα ELISA ee aadanaha (Invitrogen), qalabka ELISA ee aadanaha (Invitrogen) iyo qalabka ELISA ee aadanaha (Abcam). Sida ku xusan hab-raaca soo saaraha, ka-soo-baxa waxaa lagu qasi jiray 1:100 si loo ogaado TNFα iyo IL-2, iyo 1:3 si loo ogaado IFN-γ. Isticmaal EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) si aad u cabbirto nuugista 450 nm.
PBMC waxaa laga soocay alaabada kala soocidda leukocyte (STEMCELL Technologies) iyadoo la adeegsanayo centrifugation Ficoll gradient cufnaanta. Unugyada CD3 + waxaa laga soocay PBMC iyadoo la isticmaalayo kuul CD3 (Miltenyi). Joogitaanka ama maqnaanshaha MNA, unugyada CD3+ waxaa lagu hawlgeliyay CD3-taarikada ku xiran (5μg/ml), CD28 milmi kara (3μg/ml) iyo IL-2 (300 U/ml; Proleukin) muddo 3 maalmood ah. 3 maalmood ka dib, unugyada waa la soo ururiyay oo lagu dhaqay 0.9% cusbo, ka dibna pellet-ka waa la qaboojiyey. Tirada unugyada waxaa lagu sameeyay cytometry socodka (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R habaynta) iyadoo la isticmaalayo 123count eBeads.
Metabolites-ka soo saarista sida kor lagu sharaxay. Soo saarista la qalajiyey waxaa dib loogu habeeyay isku-darka 4000 unug oo u dhigma/μl. Falanqee muunadda iyadoo la adeegsanayo koromatografiga marxaladda rogan (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) iyo tiirka CORTECS T3 (2.1×150 mm, cabbirka walxaha 1.6-μm, cabbirka daloolka 120-Å; #186008500, Biyaha). Qalabka cabbira cufka Polar (6470, Agilent), kaas oo ionization-ka electrospray uu ku shaqeeyo qaab togan. Marxaladda moobilka A waa 0.1% asiidh formic ah (H2O), marxaladda moobilka B waa 90% acetonitrile, 0.1% asiidh formic ah. Jaangooynta LC waa 0 ilaa 2 daqiiqo 100% A, 2 ilaa 7.1 daqiiqo 99% B, iyo 7.1 ilaa 8 daqiiqo 99% B. Kadib dib u miisaami tiirka wejiga wareega A heerka socodka 0.6 ml/daqiiqo muddo 3 daqiiqo ah. . Heerka socodka waa 0.4ml/daqiiqo, qolka tiirkana waxaa lagu kululeeyaa 50°C. Isticmaal heerka kiimikada saafiga ah ee MNA (M320995, Shirkadda Kiimikada Cilmi-baarista Toronto, Waqooyiga York, Ontario, Kanada) si aad u dejiso waqtiga haynta (RT) iyo isbeddelka (RT = 0.882 daqiiqo, isbeddelka 1 = 137→94.1, isbeddelka 2 = 137→92, Beddelka 3 = 137→78). Marka saddexda kala-guur ay dhacaan waqtiga haynta saxda ah, kala-guurka 1 waxaa loo isticmaalaa cabbiraadda si loo hubiyo gaar ahaanshaha. Qallooca caadiga ah ee MNA (Shirkadda Kiimikada Cilmi-baarista ee Toronto) waxaa lagu sameeyay lix jeer oo isku-darka ah oo xalka kaydka ah (1 mg/ml) si loo helo heerarka 0.1, 1.0, 10 iyo 100 ng/ml iyo 1.0 iyo 10μg/ml siday u kala horreeyaan dareere. Xadka ogaanshaha waa 1 ng/ml, jawaabta toosanna waxay u dhaxaysaa 10 ng/ml iyo 10 μg/ml. Cirbad kasta oo laba microliters ah oo muunad ah iyo heer caadi ah ayaa loo isticmaalaa falanqaynta LC/MS, muunad isku dhafan oo xakamaynta tayada ah ayaa la sameeyaa siddeeddii irbadoodba si loo hubiyo xasilloonida goobta falanqaynta. Jawaabaha MNA ee dhammaan muunadaha unugyada ee lagu daweeyay MNA waxay ku jireen xadka toosan ee tijaabada. Falanqaynta xogta waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo software-ka falanqaynta tirada MassHunter (v9.0, Agilent).
Dhismaha jiilka labaad ee αFR-CAR waxaa laga soo qaatay Song et al. (59). Marka la soo koobo, dhismaha wuxuu ka kooban yahay waxyaabaha soo socda: taxanaha hoggaamiyaha CD8a, jajabka isbeddelka hal-silsilad ee aadanaha ee αFR, gobolka CD8a ee ku dheggan iyo xuubka transmembrane, aagga unugyada CD27 iyo aagga unugyada CD3z ee gudaha. Taxanaha CAR ee dhammaystiran waxaa sameeyay GenScript, ka dibna waxaa loo koobiyeeyay vector-ka muujinta lentiviral ee jiilka labaad ee kor u kaca cajaladda muujinta GFP ee loo isticmaalay in lagu qiimeeyo hufnaanta gudbinta.
Lentivirus waxaa lagu soo saaraa unugyada HEK293T [Ururinta Dhaqanka Nooca Mareykanka (ATCC); oo lagu beero daawada Eagle ee wax laga beddelay ee Dulbecco oo ka kooban 10% serumka lo'da ee uurjiifka (FBS) iyo 1% PenStrep, waxaana la isticmaalay vector-ka CAR-GFP. Plasmidyada baakadaha (psPAX2 iyo pMD2.G, Adgene) waxay isticmaalaan lipofection amine (Sigma-Aldrich). Supernatant-ka uu ku jiro fayraska waxaa la ururiyay 48 iyo 72 saacadood ka dib markii la tallaalay, la sifeeyay, oo lagu ururiyay ultracentrifugation. Ku kaydi supernatant-ka fayraska ee xooggan -80°C ilaa la tallaalo.
PBMC waxaa laga soocaa alaabada kala soocida leukocyte-ka deeq-bixiyaha caafimaadka qaba (STEMCELL Technologies) iyadoo la adeegsanayo centrifugation-ka Ficoll gradient cufnaanta. Isticmaal microbeads-ka CD8 ee xulashada togan (Miltenyi) si aad uga soocdo unugyada CD8+ PBMC. Kici unugyada T-ga TransAct (Miltenyi) iyo kuwa TexMACS ee dhexdhexaadka ah [Miltenyi; oo lagu kabay 3% seeramka aadanaha ee kulaylka-kicinta leh, 1% PenStrep iyo IL-2 (300 U/ml)]. Afar iyo labaatan saacadood ka dib kicinta, unugyada T-ga waxaa lagu shubay lentivirus (10 μl oo ah fayras xooggan oo ka sarreeya 106 unugba). 1 ilaa 3 maalmood ka dib wareejinta Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), waxay qiimeeyaan muujinta GFP ee unugyada si ay u muujiyaan waxtarka gudbinta ugu yaraan 30%.
Unugyada CAR-T waxaa lagu beeray muddo 24 saacadood ah Immunocult (STEMCELL Technologies; lagu daray 1% PenStrep) xaaladaha soo socda: aan la daaweyn, lagu daaweeyay 250 μM adenosine ama 10 mM MNA. Ka dib markii la daaweeyay ka hor, unugyada CAR-T waxaa lagu dhaqay PBS waxaana lagu daray 20,000 unug oo SK-OV-3 ah [ATCC; gudaha McCoy 5A medium (Sigma-Aldrich) oo lagu daray 10% FBS iyo 1% PenStrep at 10: Saamiga saamaynta ilaa bartilmaameedka ee 1 waxaa lagu kordhiyay saddex-laab gudaha dhexdhexaadka Immunocult ee lagu daray. Unugyada SK-OV-3 iyo unugyada SK-OV-3 oo lagu shiidiyay saponin digitalis (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) ayaa loo isticmaalay sidii kontaroolo taban iyo togan, siday u kala horreeyaan. Ka dib 24 saacadood oo la beeray, dheecaanka sare ee jirka ayaa la ururiyay, waxaana la cabbiray lactate dehydrogenase (LDH) iyadoo la raacayo tilmaamaha soo saaraha (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Dareeraha sare ee jirka waxaa lagu qasi jiray 1:50 oo ku jira kaydka LDH. Boqolleyda dilka waxaa lagu cabbiray qaacidada soo socota: boqolkiiba dilka = boqolkiiba sixitaanka / heerka dilka ugu badan x 100%, halkaasoo boqolkiiba sixitaanka = unugyada dhaqanka-T oo keliya, iyo heerka dilka ugu badan = xakamaynta xakamaynta-taban ee togan.
Sida ku cad qoraalka ama agabka iyo hababka, isticmaal GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ama R v3.6.0 si aad u hesho falanqaynta tirakoobka. Haddii muunado badan laga soo qaado isla bukaankii (sida ascites iyo burooyinka), waxaanu isticmaalnaa tijaabo t ah oo lammaane ah ama waxaanu bukaanka ku darnaa saamayn aan kala sooc lahayn oo ku jirta qaab toosan ama guud sida ku habboon. Falanqaynta dheef-shiid kiimikaadka, tijaabada muhiimadda waxaa lagu sameeyaa saddex-geesood.
Wixii agab dheeraad ah ee maqaalkan, fadlan eeg http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Kani waa maqaal furan oo loo qaybiyay shuruudaha Ruqsadda Hal-abuurka ee Aan Ganacsiga ahayn, kaas oo u oggolaanaya isticmaalka, qaybinta iyo taranka wax kasta oo warbaahin ah, ilaa inta isticmaalka kama dambaysta ah uusan ahayn mid loogu talagalay faa'iido ganacsi iyo ujeeddada laga leeyahay in shaqadii asalka ahayd ay sax tahay. Tixraac.
Fiiro gaar ah: Waxaan kaa codsaneynaa oo keliya inaad bixiso cinwaankaaga emaylka si qofka aad bogga kula taliso uu u ogaado inaad rabto inuu arko emaylka iyo in uusan ahayn spam. Ma qaban doonno wax cinwaanada emaylka ah.
Su'aashan waxaa loo isticmaalaa in lagu tijaabiyo inaad tahay booqde iyo in laga hortago gudbinta spam-ka ee otomaatiga ah.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini Grar Jones (R.ph Nelson) Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA waxay gacan ka geysataa xakamaynta difaaca jirka ee unugyada T waxayna u taagan tahay bartilmaameed difaac oo suurtagal ah oo loogu talagalay daaweynta kansarka aadanaha.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini Grar Jones (R.ph Nelson) Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA waxay gacan ka geysataa xakamaynta difaaca jirka ee unugyada T waxayna u taagan tahay bartilmaameed difaac oo suurtagal ah oo loogu talagalay daaweynta kansarka aadanaha.
©2021 Ururka Maraykanka ee Horumarinta Sayniska. xuquuqda oo dhan way xifdisan yihiin. AAAS waa lammaane HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef iyo COUNTER. Horumarka Sayniska ISSN 2375-2548.